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抗 体

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抗 体. 第四节 淋巴细胞抗原识别受体的 编码基因及多样性的产生. n ( 抗原表位 ) ↑↓ n(T/B 细胞克隆 ) ← n(TCR/BCR) ← n(V 基因 ) 机体存在着特异性识别各种抗原的 T 、 B 细胞克隆,称 T 、 B 细胞库 , 即 TCR 、 BCR 的多样性. 一个机体每一个淋巴细胞是不是具有这么巨大数量的 V 基因库呢? 没有。 研究证明:

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第四节 淋巴细胞抗原识别受体的

编码基因及多样性的产生

n(抗原表位)

↑↓

n(T/B细胞克隆) ← n(TCR/BCR) ← n(V基因)

机体存在着特异性识别各种抗原的T、B细胞克隆,称T、B细胞库, 即TCR、BCR的多样性

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一个机体每一个淋巴细胞是不是具有这么巨大数量的V基因库呢? 没有。

研究证明:

不同的V基因实际上是由少数原先分隔的胚系基因片段,在淋巴细胞发生分化过程中,通过重排(组合、拼接及高频突变等)的过程,从而获得了特异性的V基因,产生巨大数量特异的抗原受体以识别不同的抗原,BCR的多样性可达1014,TCR的多样性可达1016。

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一、BCR、TCR基因结构及其重排

(一)胚系基因结构:

  • 肽链编码基因: 编码V区的基因,

V区基因的下游是: 编码C区的基因

  • 重链V区基因由基因片段:V、D、J拼接
  • 轻链V区基因由V、J基因片段拼接
  • 互补决定区CDR1+CDR2←V基因片段,大部CDR3←D,其余CDR3←J 。
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14号染色体

C区的基因在V区基因的下游,1~9个,如H的C基因有9个功能性基因。

BCR/Ig的重链V区基因 是由三种胚系基因片段:V、D、J拼接而成,轻链V区基因 是由V、J两个基因片段拼接成的。互补决定区CDR1+CDR2←V基因片段,大部CDR3←D,其余CDR3←J 。

2号染色体

22号染色体

BACK

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C区的基因在V区基因的下游,1~9个,如H的C基因有9个功能性基因。C区的基因在V区基因的下游,1~9个,如H的C基因有9个功能性基因。

  • TCR的β、δ链是由三种胚系基因片段:V、D、J 拼接而成,α、γ链基因是由V、J 两个基因片段拼接成的。
  • V、D、J片段各有多个

一个淋巴细胞中只有一个片段参与组成抗原受体V区的编码基因

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14号染色体中

7号染色体q

TCR的β、δ链是由三种胚系基因片段:V、D、J 拼接而成,α、γ链基因是由V、J 两个基因片段拼接成的。

7号染色体p

BACK

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二、基因重排:

1、重组酶:重组激活酶、末端脱氧核酸转移酶、DNA外切酶、DNA合成酶等。

2、等位排斥和同种型排斥

(1)等位排斥:

在一对同源染色体的某一基因座位上,二条染色体的等位基因中只有一个基因能表达。保证了一个B细胞或T细胞只能表达一种特异性的抗原受体。

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(2)同种型排斥:

表达同一类型肽链的不同基因座位之间的排斥。如表达L链的κ链基因在第2号染色体上,而λ链基因在第22号染色体上,在一个细胞内它们不能同时表达,只能表达其中之一,κ/λ,κ:λ=65:35。

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3、类别转换(同种型转换)

在抗体应答过程中,B细胞激活后分泌Ig的类别发生转换。

类别转换主要与同一V区基因与不同重链C区基因重排有关。

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表达CH的基因片段有9个,除了Cδ以外,它们之前都有一个DNA序列重复排列的转换区,如要转换某一类别,其上游的C基因片段即被环出。表达CH的基因片段有9个,除了Cδ以外,它们之前都有一个DNA序列重复排列的转换区,如要转换某一类别,其上游的C基因片段即被环出。

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4、BCR(膜型Ig)和分泌型Ig

在转录时如只转录到SC(分泌性外显子),不能表达疏水性氨基酸残基,只能分泌出去。

如继续转录至MC(膜性外显子),则可表达疏水性的跨膜区和膜内区,插入细胞膜,作为膜受体。

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在转录时如只转录到SC(分泌性外显子),不能表达疏水性氨基酸残基,只能分泌出去。如继续转录至MC(膜性外显子),则可表达疏水性的跨膜区和膜内区,插入细胞膜,作为膜受体。在转录时如只转录到SC(分泌性外显子),不能表达疏水性氨基酸残基,只能分泌出去。如继续转录至MC(膜性外显子),则可表达疏水性的跨膜区和膜内区,插入细胞膜,作为膜受体。

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二、多样性产生的机制

1、组合造成的多样性

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2、连接造成的多样性

CDR3区位于V、J和V、D、J片段连接处,可丢失或加入数个核苷酸(N插入),在末端脱氧核苷酸转移酶作用下,不需模板,直接加入核苷酸至DNA断端,在V-D-J之间,形成VNDNJ ,而显著增加了CDR3的多样性

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3、体细胞高频突变造成的多样性

外周淋巴组织生发中心内的成熟B细胞,在受到抗原剌激后,已重排好的V区基因(尤CDR3)突变频率增高,称体细胞高频突变,主要为点突变,非随机性。抗原对多株高频突变细胞的选择结果,使其表达的的IgV区CDR(互补决定区)与抗原表位的互补性更优于原先分子,即为抗体的亲和力成熟。

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三、淋巴细胞的克隆选择

克隆选择学说:Burnet(澳) 1957年

①免疫细胞随机形成多样性的细胞系(克 隆,Clone),每一克隆细胞表达同一种特异的识别抗原受体,识别相同抗原。

②胚胎期的免疫细胞系接触抗原后,该细胞系被排除或失去活性,处于抑制状态,成为禁忌克隆,产生耐受。

③成熟淋巴细胞可识别外来抗原,被选择而活化、产生效应。

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第五节抗体的功能

一、 V区的功能 —识别并特异性结合抗原

单体(IgG, IgE)— 2价

二聚体(分泌型IgA) — 4价

五聚体(IgM)— 10价(5价)

中和效应 —中和毒素和病毒

与Ag结合 —促吞噬细胞吞噬

1.抗体的结合价

2.实际意义

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二、 C区的功能

1.激活补体系统

Ab(IgM、IgG) + Ag → C1q→补体经典途径

IgG4、IgA的凝聚物 →补体旁路途径

2.介导免疫细胞活性

(1)调理作用(opsonization):IgG + 抗原(颗粒性) → FcγR(单核、巨噬细胞及中性粒细胞) → 促吞噬细胞吞噬;

(2)ADCC:IgG + 抗原(靶细胞) → Fc γR(NK细胞)→杀伤靶细胞;

(3)介导超敏反应:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型超敏反应。

3.穿越胎盘和粘膜

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第六节 各类免疫球蛋白的特性和功能

一、IgG

1.一般特性

(1)单体分子;

(2)四个亚类;

(3)血清中含量最高(75%Ig);

(4)半衰期最长(21~23天);

(5)3~5岁达成人水平(8.0~17 mg/ml);

(6)可与SPA结合。

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2.生物学活性

(1)通过胎盘(新生儿抗感染);

(2)激活补体(裂解细胞);

(3)调理作用(促进吞噬);

(4)介导ADCC(细胞毒作用)。

3.实际意义

(1)抗感染;

(2)自身抗体 → 自身免疫病;

(3)介导变态反应(Ⅱ、Ⅲ型);

(4)封闭抗体 → 肿瘤细胞逃逸;

(5)亲合层析法 —IgG纯化;

(6)免疫学检测。

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二、IgM

1.五聚体,分子量最大(900 kd),又称巨球蛋白;

2.人类发育过程中最早合成的Ig;

3.体液免疫应答最先产生的 Ig—感染早期免疫;

4.占血清Ig含量的5~10%;

5.半衰期 5天 —血清中特异性IgM水平增高提示

有近期感染;

6.激活补体;

7.IgM不能通过胎盘 →脐带血或新生儿血清中IgM

水平升高表明胎儿有宫内感染;

8.B细胞膜IgM(mIgM) →体液免疫应答;

9.自身抗体 → 自身免疫病

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血清型: IgA1,单体;

分泌型:IgA2,二聚体,

粘膜局部浆细胞合成;

分泌片由粘膜上皮细胞合成;

三、IgA

1.两种类型

2.半衰期 6天;

3.占血清Ig含量的5~15%;

4.粘膜局部抗感染免疫;

5.聚合IgA激活补体替代途径。

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四、IgD

1.单体分子

2.存在形式 分泌型 —血清中,功能不清;

膜结合型 —B细胞表面,

3.意义

(1)是B细胞成熟的重要标志;

(2)抗原受体;

4.占血清Ig含量的1%;

5.半衰期 3天。

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五、IgE

1.单体分子;

2.血清中含量最低(占Ig的0.002%);

3.半衰期 3天;

4.呼吸道和胃肠道浆细胞产生;

5.介导Ⅰ型超敏反应;

6.过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异

性IgE水平增高。

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第七节 单克隆抗体和基因工程抗体

一、多克隆抗体(polyclonal antibody)

1.定义 指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清(含多种特异性抗体)。

2.实际意义

(1)预防、治疗感染性疾病

(2)临床诊断

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二、单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)

1.定义由单一克隆B细胞杂交瘤产生的,只识别抗

原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。

2.特点 具有高度均一性。

3.杂交瘤细胞

骨髓瘤细胞 —无限增殖;

免疫B细胞 —合成、分泌特异性抗体。

4.杂交瘤技术

HAT培养基:次黄嘌(H), 氨基蝶呤(A)和胸腺嘧

啶核苷(T)。

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杂交瘤技术的理论基础

  • 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说,即一种克隆只产生一种抗体
  • 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性
  • 利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞,并克隆化,制备McAb
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细胞DNA合成途经

1.替代途径:次黄嘌呤(H)

HGPRT

2.主要途径:

氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸

谷 氨 酰 胺 (A-)

尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸

TK

3.次要途径:胸腺嘧啶核苷(T)

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HAT选择培养基的原理

  • HAT选择培养基组分

次黄嘌呤(hypoxanthine,H)

氨甲喋呤(aminopterin,A):叶酸拮抗剂

胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)

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抗原免疫的脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞 (B细胞) (B细胞恶性肿瘤) 1. 抗体分泌(Ig+) 1.具永生性 2.HGPRT+在HAT生长 2.8-AG筛选出HGPRT-株PEG 融合 HAT筛选 脾-骨髓瘤细胞(杂交瘤细胞) (HGPRT+、Ig+)

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融合的结果及命运

未融合的骨髓瘤细胞

杂交瘤细胞

脾-脾杂交细胞

未融合的脾细胞

骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞

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免疫动物 培养骨髓瘤细胞

收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞

细胞融合

HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞

检测筛选阳性细胞

克隆化培养(反复3-5次)

获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株

McAb的制备(杂交瘤培养上清或诱生腹水)

McAb 纯化及鉴定

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制备单克隆抗体的基本技术

1 抗原提纯与动物免疫

2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备

3 细胞融合

4 抗体检测

5 杂交瘤的克隆化和冻存

6 McAB的制备

7 单克隆抗体的纯化

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免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞,此时血清中抗体效价不一定最高。免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞,此时血清中抗体效价不一定最高。
  • 可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免疫(量减半,改用不完全佐剂,可反复多次) 冲击免疫(融合前3天进行)
  • 选用6-12周龄Balb/c小鼠 
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颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果
  • 可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂
  • 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,促进免疫细胞对抗原反应性。
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骨髓瘤细胞系选择要点:
  • 稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株
  • 常用骨髓瘤细胞系有:NS1、SP2/0、X63 等。
  • 保存:防止突变、定期筛选(8-氮鸟嘌呤)

防止支原体污染(胎牛血清)

  • 融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期,良好的形态,活细胞计数高于95%
  • 融合比例 脾细胞:骨髓瘤细胞=3:1许多环节需要加饲养细胞,如:在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中
  • 常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞
  • 饲养细胞一般在融合前一天制备
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免疫脾细胞:处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。免疫脾细胞:处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。
  • 融合比例:
  • 骨髓瘤细胞:脾细胞=1:5或1:10
  • 融合剂:40%PEG(分子量1000-2000)
  • 融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液 2周后 改用一般培养液
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克隆化:指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化:指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。
  • 克隆化的原则:尽早进行,反复4-5次
  • 克隆化方法:有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法
  • 阳性杂交瘤细胞应及时冻存,防染色体丢失、变异及污染
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一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时,开始检测特异性抗体,筛选出所需杂交瘤细胞系。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时,开始检测特异性抗体,筛选出所需杂交瘤细胞系。
  • 可靠的筛选方法须在融合前建立,避免由于方法不当贻误筛选时机。
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克隆化:指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化:指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。
  • 克隆化的原则:尽早进行,反复4-5次
  • 克隆化方法:有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法
  • 阳性杂交瘤细胞应及时冻存,防染色体丢失、变异及污染
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单抗生产的方法:
  • 动物体内诱生法:小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡,1周后腹腔注射杂交瘤细胞,7-10天后出现腹水,无菌采集。
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单抗纯化方法:
  • 盐析
  • 凝胶过滤
  • 离子交换层析
  • 亲和层析法
  • 辛酸沉淀法
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单抗生产的方法:
  • 动物体内诱生法:小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡,1周后腹腔注射杂交瘤细胞,7-10天后出现腹水,无菌采集。
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单克隆抗体特性
  • 理化性状高度均一,生物活性专一,只与一种抗原表位发生反应,特异性强,纯度高,易于实验标准化和大量制备
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单克隆抗体在医学中的应用
  • 检验医学诊断试剂
  • (1)病原微生物抗原抗体的检测
  • (2)肿瘤抗原的检测
  • (3)免疫细胞及其亚群的检测
  • (4)激素测定
  • (5)细胞因子的测定
  • 蛋白质的提纯
  • 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
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基因工程抗体与抗体库技术
  • 单抗体内应用和疗效受限原因:
  • 1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性
  • 2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少
  • 3.生产成本高,难于普及应用
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人杂交瘤技术未获真正突破原因:
  • 融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫
  • 基因工程抗体:用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗基因,着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源成分,但又尽量保留原有的抗体特异性。
  • 抗体库技术:用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体,不经细胞融合,甚至不经免疫,制备针对任何抗原的单克隆抗体。
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临床上欲开展急性心肌损伤特异性标志物—人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的检测项目,现提供给你重组cTnI抗原,请你设计可行性实验方案。临床上欲开展急性心肌损伤特异性标志物—人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的检测项目,现提供给你重组cTnI抗原,请你设计可行性实验方案。
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三、基因工程抗体(genetic engineering antibody)

1.定义 在DNA水平对Ig基因进行切割、拼接或修

饰,导入受体细胞表达的抗体。

2.举例 人-鼠嵌合抗体(chimeric antibody)

改型抗体(reshaped humanized antibody)

小分子抗体

双特异性抗体(bispecific antibody)

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