DESCUBRIENDO LA ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS Lucía Pérez Coello

1. DESCUBRIENDO LA ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS Lucía Pérez Coello ESCIVE 2009

2. A alumna Lucía Pérez Coello, de 2º de bacharelato do I. E. S. Otero Pedrayo de Ourense, estivo durante o verán do 2009 no IBCM (Instituto de Bioloxía Celular e Molecular de Oporto), participando no programa Estancias Científicas (ESCIVE), organizadas en España pola Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT). A CONTINUACIÓN PRESÉNTANOS O TRABALLO DESENVOLVIDO DESPOIS DA SÚA ESTANCIA.

3. ESCIVE OBJETIVO: impulsar el contacto de jóvenes de entre 15 y 17 años con el trabajo cotidiano en centros y departamentos de investigación españoles y portugueses.

4. IBMC http://www.youtube.com/watch?v=cehkhV6AIlA&feature=player_embedded

5. MECANISMOS DE ADAPTACIÓN CELULAR InstitutoBiologíaMolecularCelular SEÑAL E IMAGEN BIOMATERIALES BIOLOGÍA MOLECULAR Y ESTRUCTURAL BIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN E INMUNOLOGÍA GENÉTICA HUMANA Y DOLENCIAS GENÉTICAS NEUROBIOLOGÍA BÁSICA Y CLÍNICA

6. Descubriendo la estructura de las proteínas Lucía Pérez Coello Felipe Demígio Fernandes Pereira ESCIVE – Ciencia Viva 2009

7. Objetivo • Estudiar la estructura de las proteínas; • Comprender su función; • Determinar los mecanismos de funcionamiento e interacción con otras moléculas.

8. Lisozima • Enzima • Estructura tridimensional determinada por primera vez por David Phillips, en 1965. • Se encuentra en las lágrimas, saliva y moco humanos. • Producida por varios organismos. • Destruye la pared celular de las bacterias. Estrutura primária da Lisozima

9. Pasos para determinar estructuras de proteínas

10. 1. Producción de proteínas • Clonación • Expresión (Escherichia coli) • Purificación • Filtración en gel • Intercambio iónico • Afinidad Cromatografia

11. 2. Cristalización Las proteínas, como muchas moléculas, pueden ser llevadas a formar cristales cuando son colocadas en condiciones apropriadas. Para que cristalice, la proteína purificada es sometida a una precipitación lenta a partir de una disolución acuosa. ENSAIOS DE CRISTALIZACIÓN MEJORA DE LOS CRISTALES CONDICIONES DE CRISTALIZACIÓN OPTIMIZACIÓN

12. Métodos de cristalización • Diálisis • Difusión en gel • Gota colgante • Gota sentada

13. Diagram of hanging drop method. Reservoir solution (blue) usually contains buffer and precipitant. Protein solution (red) contains the same compounds, but in lower concentrations. The protein solution may also contain trace metals or ions necessary for precipitation of particular proteins (McRee, 1993).

15. Preparamos 3 disoluciones (de concentraciones diferentes) que contengan Lisozima en 0,1 M NaAc pH 4.8 • Disolución reservorio: 1 ml de 10% (m/v) NaCl, 0,1 M NaAc pH 4,8 e 25% (v/v) Etilenoglicol • La gota de la lámina contiene: 6-7 L de disolución de Lisozima y 4-3 L de disolución reservorio (volumen total de 10 L) 30 mg/mL 20 mg/mL 10 mg/mL • Ponemos las láminas sobre los pozos y los sellamos con silicona • Los cristales deben crecer dentro de 1-2 días y estar preparados para enfriamiento criogénico. (L) 8+2 7+3 6+4 5+5

18. NUESTROS CRISTALES

25. Próximos pasos http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/73/X_ray_diffraction.png

26. Se obtiene una muestra y se somete a enfriamiento criogénico para evitar que se desestabilice.

27. Difractómetro

28. Montaje del cristal

29. 3. Difracción

30. Ley de Bragg : n= 2d sin 

31. Construyendo el modelo Los mapas de densidad electrónica son el resultado final del experimento de difracción. Su interpretación en términos de un modelo molecular es la primer tarea del cristalográfo.

33. Estructuras en 3D Lysozyme

35. http://lysozyme.co.uk/lysozyme-structure.php

37. Presentación del trabajo realizado

39. FIN