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第十八章支原体、 衣原体、立克次体. 第一节支原体 是一类缺乏细胞壁、形态上呈高度多形性，能通过除菌滤器，在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物。由于它们能形成有分支的长丝，故称之为支原体。. 支原体科分支原体属和脲原体属两个属。对人致病的主要为肺炎支原体、人型支原体、生殖器支原体、穿通支原体和溶脲脲原体。除此之外，支原体还经常污染细胞培养，给实验室病毒分离、单克隆抗体制备等工作带来一定困难。. 一、肺炎支原体. 感染呈全球性分布，主要侵犯呼吸系统,借滑行运动穿过粘膜上皮细胞纤毛屏障，主要粘附因子为一类对胰酶敏感的表面蛋白，称 Pl 蛋白。.
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第十八章支原体、 衣原体、立克次体 第一节支原体 • 是一类缺乏细胞壁、形态上呈高度多形性，能通过除菌滤器，在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物。由于它们能形成有分支的长丝，故称之为支原体。
支原体科分支原体属和脲原体属两个属。对人致病的主要为肺炎支原体、人型支原体、生殖器支原体、穿通支原体和溶脲脲原体。除此之外，支原体还经常污染细胞培养，给实验室病毒分离、单克隆抗体制备等工作带来一定困难。支原体科分支原体属和脲原体属两个属。对人致病的主要为肺炎支原体、人型支原体、生殖器支原体、穿通支原体和溶脲脲原体。除此之外，支原体还经常污染细胞培养，给实验室病毒分离、单克隆抗体制备等工作带来一定困难。
一、肺炎支原体 • 感染呈全球性分布，主要侵犯呼吸系统,借滑行运动穿过粘膜上皮细胞纤毛屏障，主要粘附因子为一类对胰酶敏感的表面蛋白，称Pl蛋白。
微生物特性 1．形态与结构 类似酒瓶状，没有细胞壁，仅有细胞膜。G-易着色，Giemsa染色呈淡紫色。细胞膜中胆固醇含量多。所有肺炎2株共同具有P1蛋白，是主要特异性免疫原和血清学诊断的主要抗原。
2.抗原结构 来自细胞膜，胞膜外层蛋白质是主要抗原， 常用生长抑制试验(GIT)与代谢抑制试验 (MIT)鉴定。GIT是将吸有型特异性抗血清 的滤纸片置于接种有支原体的固体培养基上， 经孵育出现同型血清抑制该型支原体生长现 象。MIT是将支原体接种在含有抗血清培养 基中，若抗体与支原体型一致，则抑制该支 原体不能分解葡萄糖产酸。此两种方法可将 支原体分成若干血清型。
3．培养特性 以二分裂繁殖，繁殖较慢；生 长需要胆固醇；反复传代后呈“荷包蛋” 状菌落，可迅速溶解哺乳动物红细胞。 4．生化反应 肺炎支原体可根据是否能利用 葡萄糖、水解精氨酸和尿素来与其他支原 体进行鉴别。
5.抵抗力 1.对热的抵抗力一般与细菌相似。耐冷， -70℃或液氮可长期冻存, 4℃放置也不 要超过3天。 2.支原体对干燥敏感，干燥的标本难以分离出支原体。没有细胞壁青霉素不敏感。
检验程序 1 .标本采集 肺炎支原体有粘附细胞作用，以 咽拭子标本为好，取材后宜立即接种。 2. PCR法快速、敏感和特异，目前某些临床实 验室以特异性引物通过这一技术从患者痰中 检测肺炎支原体DNA。 3. 电子显微镜观察无细胞壁，易与细菌鉴别。
4.分离培养 • 以牛心消化液为基础,加20％小牛血清及新鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基。加入青霉素,可防止杂菌生长。初次分离生长缓慢，在含5％C02下培养，10天长出油煎蛋状菌落。能发酵葡萄糖产酸，不能利用精氨酸与尿素，可还原美蓝。分离培养阳性率不高，对临床诊断意义不大, 但对流行病学调查有重要意义 。
5．抗体检测 (1)ELISA：此法敏感，特异性高，快速、经济，并可检测IgM和IgG抗体，为目前诊断的可靠方法。检测分子量190kDa的P1蛋白，3h可完成试验，特异性高，敏感性为10 4CFU／μl标本。
(2)补体结合(CF)试验 • 试验所用的抗原为氯仿·甲醇提取的糖脂类抗原。 • 双份血清试验，效价呈4倍增长者，或单份血清效价≥l：128者，80％的病例表明近期有肺炎支原体感染。
(3)间接血凝试验 • 操作简便，敏感度略高于补体结合试验，感染发病后7天出阳性，10-30天达高峰，12-26周逐渐降低。 • 本试验与补体结合试验类似，主要测lgM 抗体，与生殖道支原体之间存在交叉反 应。
(4)冷凝集试验 是一种非特异性试验。其方法是将患者血清与O型Rh阴性红细胞在4 ℃下作凝集试验。有33％—76％肺炎支原体感染者为阳性 (效价≥1：64)。效价越高或双份血清呈4倍以上升高，肺炎支原体近期感染的可能性越大。
二、解脲脲原体 • 也称溶脲脲原体，是1954年Shepard首先从非淋菌性尿道炎(NGU)患者的尿道分泌物中分离获得，因其分解尿素的特性命名为解脲脲原体。在分类学上属人支原体科脲原体属。是人类泌尿生殖道最常见的寄生菌之一，近年来研究发现，它与多种疾病有关，故引起国内外有关学者的广泛重视。
1.寄居泌尿生殖道，传播途径为性接触和母婴传播。致病机制与侵袭性酶有关。吸附后产生磷脂酶分解胞膜中的磷脂，脲酶分解尿素产氨，影响宿主细胞生物合成。产生IgA蛋白酶，破坏IgA的局部抗感染作用，有利于粘附和致病。1.寄居泌尿生殖道，传播途径为性接触和母婴传播。致病机制与侵袭性酶有关。吸附后产生磷脂酶分解胞膜中的磷脂，脲酶分解尿素产氨，影响宿主细胞生物合成。产生IgA蛋白酶，破坏IgA的局部抗感染作用，有利于粘附和致病。
2.引起非淋菌性尿道炎(NGU) ，上行感染，可引起前列腺炎或附睾炎；阴道炎和宫颈炎，并可导致流产。因为与人精子膜有共同抗原，对精子可造成免疫损伤而致不育。
微生物特性 1．形态结构 在液体培养基中以球形为主，直径约50-300nm，单个或呈双排列，能通过微孔滤膜；G-但不易着色，姬姆萨染色呈紫蓝色。无细胞壁，细胞膜由三层膜构成。内、外两层由蛋白质组成，中层为类脂质，胞内含核糖体和双股DNA。DNA中Ｇ十C含量为26．9～29．8mol％。
2．培养特性 • 营养要求较高，需要供给胆固醇和酵母，常用的基础培养基为牛心消化液。37℃生长良好，22℃生长差，42℃不生长，最适pH为5．5-6．5。在含95％N2和5％C02气体环境下培养2天形成很小菌落，呈“荷包蛋”样，放大200倍才能观察到，故称T株。生长除胆固醇外，尚需尿素，有脲酶能水解尿素产氨，不分解葡萄糖和精氨酸。
3.抗原构造 • 有脂多糖、脲酶和蛋白质抗原，有16个血清型划分为A、B两大群，其中以4型引起疾病频率高。A群各型均含有16kD和17kD多肽；B群各型仅含17kD多肽；而13血清型只含有16kD多肽，以能识别16kD和17kD多肽的单抗，为区别血清群特异性标志。
4．抵抗力 • 由于无细胞壁，对渗透作用特别敏感，易被脂类溶媒、清洁剂、酒精、特异性抗体和补体溶解。对热抵抗力差。在4℃存活约2周左右，—70℃中可存活 2-3年。 • 对青霉素等作用于细胞壁的抗生素不敏感，对影响胞浆蛋白合成的抗生素敏感：对强力霉素、红霉素、交沙霉素、白霉素、螺旋霉素、氯霉素、麦迪霉素、链霉素、丁胺卡那霉素等敏感。
微生物检验 1．标本采集 用无菌瓶收集诊断为非淋菌性尿道炎患者中段尿，慢性前列腺炎按摩后的前列腺液，原因不明的不育症患者的精液，阴道炎与宫颈炎患者的炎性分泌物，羊水和血液等。尿标本以无菌方法取10ml，离心沉渣作接种物。
2．标本直接检查 (1)核酸检测 • 16个血清型均有460bp的DNA片段。通过对PCR产物的核酸杂交和序列分析，可将各种支原体鉴别分类。鉴于本法敏感性高、稳定可靠、快速简便，将成为临床快速诊断的重要实验手段。 • DNA探针技术法敏感，可测出50～100pg的DNA。
(2)ELISA 可测定血清型别，还可测出Ig的类型(IgM、IgG)，较敏感、特异性强，有诊断意义。 (3)免疫斑点试验(IDT) 检测抗原提取物和培养物。此法敏感，特异性，不需特殊仪器，易于推广，可作为临床感染者病原检查的特异诊断方法。
3．分离与鉴定 • 取标本O．1～0．2ml接种于pH6．0含有酚红和尿素的液体培养37℃孵育，颜色由黄变红者为阳性。阳性者转种于固体培养基上，琼脂培养基中有尿素、0．05molHEPES缓冲液和MgS04，菌落呈黑褐色易辨认 ，95％N2～5％C02或微厌氧环境中作次代培养，以低倍镜观察菌落形态。
三、穿通支原体 • 能粘附、穿入淋巴细胞和单核吞噬细胞中大量复制，导致宿主细胞受损和死亡。能促进HIV的复制和病程的发展，是艾滋病的辅助致病因素。
为杆状，一端为尖形结构。营养要求高，菌落呈荷包蛋样，生长较慢，初代多在10天以上，发酵葡萄糖，水解精氨酸，但不分解尿素，液体培养基生长时无明显混浊或沉淀。为杆状，一端为尖形结构。营养要求高，菌落呈荷包蛋样，生长较慢，初代多在10天以上，发酵葡萄糖，水解精氨酸，但不分解尿素，液体培养基生长时无明显混浊或沉淀。 • 对红霉素、四环素、林可霉素敏感，但对青霉素不敏感。
微生物检验 1．标本采集 取材对象是AIDS患者或HIV 感染者。用咽拭子。 2．选SP-4培养基分离培养，37℃温箱培养， 每天观察颜色有无变化，若由红变黄透明 无沉淀，视“培养可疑阳性”，再用滤膜过 滤。滤液转种传代，当培养基颜色再度由 红变黄，则认为“初代培养阳性”。
3.鉴定 生化反应 (1)培养物接种于含1％葡萄糖的SP-4培养基 (发酵葡萄糖试验)，若能分解它，培养基 颜色由红变黄。 (2)培养物接种于含有精氨殿(不含葡萄糖) 的SP-4培养基(水解精氨酸试验)中，若 能水解它，pH上升。 (3)培养物接种于仅含尿素的SP-4培养基(分 解尿素试验)中，观察 pH变化。
代谢抑制试验(MIT) • 取104CFU／ml阳性培养物分别加入2支含3ml改良的SP-4培养基中，其中1支加入适量抗Mpe标准血清作为试验管，另1支不加抗血清作为对照管，37℃培养。 • 试验管颜色不变(生长被抑制)，对照管颜色由红变黄(支原体生长)。生长被杭血清抑制的管为MIT阳性，该培养物则为Mpe，根据抗血清的型别进行Mpe分型。
PCR 用Mpe套式PCR(nPCR)，靶基因为Mpe的16SrRNA基因特异性片段。Mpe-nPCR最终扩增长度为410bp，按试剂盒说明书操作，能扩增出特异性MpeDNA，认为此法更灵敏、特异、快速的Mpe检测方法。
抗体检测 • 国外学者在HIV感染者中用ELISA法检测出大量Mpe抗体，其中无症状者的阳性率为20％，有艾滋病者为40％，阴性对照0.3％。
第二节 衣 原 体 • 是一类专性细胞内寄生、有独特发育周期、能通过细菌滤器的原核细胞型微生物。归属于广义的细菌范畴。 • 衣原体科包括沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和家畜衣原体等四种。
一、沙眼衣原体 • 不仅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系统感染、性病淋巴肉芽肿以及其他器官疾病。 • 近年沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌而居性传播疾病之首，因而日益受到医学界的重视。 • 沙眼衣原体有沙眼生物变种、性病淋巴肉芽肿生物变种（LGV）和鼠生物变种等3个生物变种。
1．沙眼亚种 (1)沙眼： 通过眼-手-眼途径直接或间接密切接触传 播。由A、B、Ba和C血清型引起。结膜引 起局部炎症。有滤泡增生。后期出现瘢痕 及角膜血管翳，影响视力。
(2)包涵体结膜炎： 由B、Ba、D、Da等血清型引起。婴儿通过 产道感染，引起滤泡性结膜炎，不出现角 膜血管翳。 (3)泌尿生殖道感染： 由D-K血清型引起。在性接触传播引起的 非淋菌性泌尿生殖道感染（50％—60％）。 易发展为持续感染或无症状携带者。
2.性病淋巴肉芽肿亚种，由L血清型引起性病淋巴肉芽肿。侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。2.性病淋巴肉芽肿亚种，由L血清型引起性病淋巴肉芽肿。侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。 3.鼠生物变种为鼠间传播，不侵犯人，与鼠肺炎有关。
微生物特性 1．发育周期与形态染色 衣原体具有特殊的发育周期。①原体是细胞外存在形式，卵圆形，有胞壁和拟核, 是发育成熟的衣原体，具有高度感染性，能吸附于易感细胞特异受体，增大形成网状体；②网状体或称始体，圆形，二分裂增殖为繁殖型，无感染性。于感染24h后浓缩形成原体，最后细胞破裂释放原体，再感染其他细胞，每个发育周期约需48—72h。
抗原结构 复杂，有属、种、型等特异性抗原。 (1)属特异性抗原：为胞壁LPS，属特异性补 体结合抗原，应用于血清学诊断。 (2)种特异性抗原：位于主要外膜蛋白 （MOMP）上，可用补体结合试验和中和 试验检测。 (3)型特异性抗原：也位于MOMP上，用单 克隆抗体作微量免疫荧光试验能识别沙眼 体的18个型别。
培养特性 • 沙眼衣原体专性活细胞内寄生，用6—8d龄鸡胚卵黄囊及各种传代细肋培养。一般培养48—72h后可在细胞内查到包涵体及原体和始体颗粒。 • 近年多采用细胞培养衣原体，常用的细胞株为Hela-299和McCoy。
抵抗力 • 沙眼衣原体感染材料在37℃条件下，经48h左右即失去活力，56℃6 min灭活。-70℃可保存数年，冷冻干燥可保存30年以上仍有活性。O.1％甲醛或O.5％石炭酸溶液24h杀死沙眼衣原体，2％来苏仅需5min。 • 红霉素、四环素、强力霉素或青霉素对衣原体有抑制作用。
沙眼和包涵体结膜炎病人，用拭子在结膜上穹窿涂擦或取结膜刮片。性病淋巴肉芽肿：采淋巴结脓汁，也可取直肠拭子或活检材料送检。沙眼和包涵体结膜炎病人，用拭子在结膜上穹窿涂擦或取结膜刮片。性病淋巴肉芽肿：采淋巴结脓汁，也可取直肠拭子或活检材料送检。 用光学显微镜观察包涵体有诊断意义，特别在眼结膜、尿道及子宫颈上皮细胞内发现典型包涵体更有沙眼衣原体感染的参考。
免疫学方法 1)免疫荧光检查：用荧光抗体检测上皮细胞内衣原体抗原。标记抗衣原体LPS抗体，可与所有衣原体反应；而抗MOMP抗体有种、型特异性。可在1h内即作出诊断并可分型。 2)酶免疫检测：能在数小时内检测出衣原体可溶性抗原，并适用于同时检测大量标本。
核酸检测 1)核酸杂交：用125I标记的衣原体rDNA探针检测宫颈标本的敏感性和特异性，与培养相比分别为82.8％和99.4％。 2)PCR：具有高度敏感性和特异性。一般按沙眼衣原体7．5kb质粒、MOMP序列及16SrRNA基因序列设计引物。
分离培养 • 将标本拭子，用含抗生素的稀释液制成10％-20％悬液。分离的细胞有McCoy、HeLa-229细胞等。置5％CO2下培养。 • 初代分离培养72-96h后传代或盲传。有症状病人90％标本第1代即可见包涵体，而无症状病人需传代后才得到阳性。 • 敏感性为80％-90％，特异性100％，是目前确诊最可靠的方法，而且是评价实验室诊断法的标准。
鸡胚培养 • 有细菌污染的临床标本加适当的抗生素(如链霉素、庆大霉素和制霉菌素等)肉汤，在室温中作用lh后，接种3-4只孵育7天的鸡胚卵黄囊，35℃孵育，观察至13天，收获卵黄囊涂片，作Gimenez染色，镜检原体。
鉴定 1.将细胞培养盖片用Giemsa或碘染色镜检胞质内包涵体。Giemsa染色比碘染色敏感，可作为鉴别沙眼衣原体的参考。 2.可用型特异性荧光血清鉴定其型别。对于卵黄囊和小鼠分离的材料可用免疫荧光法鉴定原体或补体结合抗原 。
抗体检测 • 目前检测抗体的血清学方法在常规临床诊断中价值很小。 • 原因是不易获得双份血清，而且性传播疾病的高危人群多有慢性重复感染，原有的抗体水平较高，因而限制了血清学方法的诊断价值。 • 方法有补体结合试验(CF)、微量免疫荧光试验(MIF)、酶免疫法等。其中CF敏感性和特异性较差，而MIF敏感性和特异性较高。
三、鹦鹉热衣原体 • 鹦鹉热衣原体是鹦鹉热的病原体，主要引起禽畜感染，也可由动物传染到人，引起肺炎和毒血症，亦有引起心内膜炎的报道。 • 也有衣原体独特的生活周期，包涵体较致密，形态不一，碘染色阴性，是与沙眼衣原体鉴别要点 (沙眼衣原体含糖原，碘染色阳性)。
