Le cytosquelette
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Le cytosquelette. I - Les principes communs aux trois types de filaments, assemblage, désassemblage II - Régulation des filaments du cytosquelette III - Les moteurs moléculaires IV - Fonctions du cytosquelette dans la cellule. II - Régulation des filaments du cytosquelette.

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Presentation Transcript


Le cytosquelette

Le cytosquelette

I - Les principes communs aux trois types de filaments, assemblage, désassemblage

II - Régulation des filaments du cytosquelette

III - Les moteurs moléculaires

IV - Fonctions du cytosquelette dans la cellule


Ii r gulation des filaments du cytosquelette

II - Régulation des filaments du cytosquelette


Dynamisme des l ments du cytosquelette

Dynamisme des éléments du cytosquelette

  • Régulation des filaments en longueur, stabilité, nombre et géométrie

  • Interagissent les uns avec les autres et avec les autres composants de la cellule

  • Parfois liaisons covalentes de protéines accessoires

    • Soit avec les sous-unités

    • Soit avec le filament


Le cytosquelette

Plan

  • Nucléation

  • Protéines de liaison  dynamisme du cytosquelette

  • Organisation d'ordre supérieur

  • Fixation des éléments du cytosquelette à la membrane plasmique


A nucl ation

A – Nucléation

  • Nucléation des microtubules

    • -tubuline

    • Centrosome

    • Autres cas

  • Nucléation des microfilaments


1 nucl ation des microtubules

1 - Nucléation des microtubules

  • Centre Organisateur des MicroTubules (COMT) = site de nucléation des microtubules dans la cellule

  • -tubuline = nucléation des microtubules

  • De la levure à l'homme

  • Présente dans tous les COMT

  • -tubuline ring complex (-TuRC) = COMT très puissant


A nucl ation des microtubules par la tubuline

a) - Nucléation des microtubules par la -tubuline

  • Nucléation à l’extrémité moins

  • Allongement par l’extrémité plus

  • Intervention de deux protéines qui se fixent directement à la -tubuline


Fig16 22

Fig16-22

Nucléation d'un microtubule par -TuRC

Présence des deux protéines plus des protéines accessoires pour aider à la création de l’anneau

-tubuline ring complexes en microscopie électronique

MT nucléés à partir de -tubuline ring complexes purifiés


Moritz m2001 fig1

Moritz,M2001(fig1)

Modèles de nucléation des microtubules

Microtubule nucléé spontanément à partir de tubuline / pure

Modèle avec matrice

Modèle protofilament


Moritz m2001 fig2

Moritz,M2001(fig2)

  • Structure de -tubuline ring complexes isolés de drosophile

Dgrip Drosophila gamma ring protein


Moritz m2001 fig4

Moritz,M2001(fig4)

New models of microtubule nucleation by the -TuRC or monomeric -tubulin

TuSC : -tubulin small complex

Dgrip : Drosophila gamma ring protein


B le centrosome principal centre organisateur des microtubules

b) - Le centrosome : principal centre organisateur des microtubules

Situé près du noyau

Émanation des microtubules en étoile à partir du centrosome

Extrémité - des MT dans le centrosome

Extrémité + des MT en périphérie

Contient plus de 50 copies de -TuRC dans sa matrice

Contient une paire de centrioles


Fig16 23

Fig16-23

Le centrosome


Les centrioles

Les centrioles

  • id corpuscules basaux des cils et des flagelles

  • Matériel péricentriolaire = matrice centrosomale

  • Duplication des centrioles suivie de la duplication des centrosomes

  • cf. mitose


Structure des centrioles

Structure des centrioles

  • Cylindre de microtubules + protéines accessoires


Fig16 24

Fig16-24

Un centriole dans un centrosome

Matrice centrosomale fibreuse


C cas particuliers de comt

c) - Cas particuliers de COMT

Champignons et diatomés

pas de centriole

plaques incluses dans l'enveloppe nucléaire : corps du pôle du fuseau

Plantes supérieures

pas de centriole

COMT répartis tout autour de l'enveloppe nucléaire

Présence de -tubuline dans tous les cas


Orientation des microtubules

Orientation des microtubules

  • Configuration en étoile des microtubules

  • Extrémité plus tournée vers l’extérieur de la cellule

  • Extrémité moins tournée vers le noyau

  • Dispositif de surveillance

    • de la périphérie de l’intérieur de la cellule

    • et de la position centrale du centrosome

  • conservé même in vitro…


Fig16 25

Fig16-25

Positionnement du centrosome au centre de la cellule

Centrosome isolé + tubuline dans une chambre artificielle en plastique (image toutes les 3 minutes)


Holy te1997

Holy,TE1997

Positionnement des COMTs dans des micro-chambres

  • Positioning of MTOCs in microfabricated chambers. (a) Three differential interference contrast images of a centrosome in a square chamber. The chamber is 4 μm deep and the tubulin concentration is 3.2 mg/ml. Images are 3 min apart. The slope of the well dominates the signal close to the edges of the chamber. (b) Three fluorescence images of an AMTOC in a square chamber. The chamber is 6 μm deep and the tubulin concentration is 1.4 mg/ml. Time is indicated in each frame. (c) An aster regrown from an AMTOC in 2.3 mg/ml tubulin, stabilized by diluting with 30% (vol/vol) glycerol/BRB80, spun down through a cushion of 40% glycerol/BRB80 onto a coverslip coated with 3-aminopropyltriethoxysilane, and fixed with glutaraldehyde. Image taken by confocal fluorescence microscopy. (d) Two centrosomes in a square chamber. (All bars are 10 μm.)


Fig16 26

Fig16-26

Mélanophore de poisson


Mt point de rep re dans la cellule

MT = point de repère dans la cellule

  • Permet de retrouver le centre de la cellule

  • Permet de disposer les organites dans les cytosol

  • Propriété intrinsèque des microtubules


2 nucl ation des microfilaments d actine

2 - Nucléation des microfilaments (d'actine)

(Nucléation des MT : près du noyau)

Nucléation des microfilaments : sur la membrane plasmique  accumulation de microfilaments en périphérie  définit le cortex cellulaire

Cortex cellulaire

Couche de filaments d’actine accumulés sous la membrane plasmique

Détermine la forme et le mouvement de la surface cellulaire  forme

1-D : microvillosités, spicules, filopodes

2-D : lamellipodes


Fig16 27

Anciens filaments existant avant la perméabilisation

Fig16-27

Bord avant d’un fibroblaste : nucléation des MF

Incubation avec actine-rhodamine visualisant les nouveaux filaments d’actine

5 m

Nouveaux filaments formés sur le bord avant: site de nucléation des filaments


Symons mh1991p503

Symons,MH1991p503

  • Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts

    • MH Symons and TJ Mitchison J. Cell Biol. 1991 114: 503-513

  • Figure 2. Localization of rhodamine-actin incorporation in fibroblasts fixed shortly after injection. (a-c) shows a detail of a cell simultaneously permeabilized and fixed 24 s after injection.

    • (a) Rhodamine stain, showing newly incorporated actin. The arrows outline the section corresponding to the profiles in (d).

    • (b) Fluorescein- phalloidin stain, showing both preexisting and newly incorporated filaments;

    • (c) rhodamine/fluorescein ratio image, the arrowheads delineate the lamellipodium, and correspond to the fat arrows marked in the intensity profiles . The appearance of the stress fibers in the ratio image (c) as yellow over a red background, while they are not visible in the rhodamine image (a) itself, is caused by the higher background in the perinuclear part of the rhodamine image, which is divided by the stress fibers in the corresponding area of the fluorescein image (b) .

    • (d) Not shown Normalized intensity profiles from the respective channels along the lines delineated by arrows in a. ( - ) Fluorescein profile; ( - - - -) rhodamine profile. The fat arrows in ddelineate the lamellipodium, the thin arrow indicates the front of the wave of incorporated actin. See Materials and Methods for further details. The color scale from green to purple corresponds to low and high rhodamine/fluorescein ratios, respectively.

    • Bars, (b) 10 /,m; (d) 2 .5 Am.

  • Figure 4. Steady-state incorporationof injected actin, showing a detail of a cell fixed 20 min after injection.

    • (a) Rhodamine stain, showing the incorporated actin. The arrows outline the section corresponding to the profiles in d.

    • (b) Phalloidin stain .

    • (c) Rhodamine/ fluorescein ratio image, arrowheads delineate the lamellipodium boundaries .

    • (d) Not shown Normalized intensity profiles along the section marked in a. Full-line fluorescein profile and dashed line, rhodamine profile. Fat arrows delineate the lamellipodium.

    • Bars : (b) 10 um; (d) 2.5 gym.

Contrôle de la polymérisation de l’actine dans des fibroblastes vivants et perméabilisés


Symons mh1991p5031

Symons,MH1991p503

  • Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts

    • MH Symons and TJ Mitchison J. Cell Biol. 1991 114: 503-513

  • Figure 5.Rhodamine-actin incorporation in saponin-permeabilized cells.

    • (a) rhodamine stain, showing exogenous actin incorporation ;

    • (b) fluorescein-phalloidin stain, showing preexisting and newly incorporated filaments;

    • (c) rhodamine/fluorescein ratio, arrowheads outline the lamellipodial boundary

    • (d) not shown / intensity profiles along the arrows shown in a. For this experiment 0.4 t.M RA was added together with 0.2 mg/ml saponin in permeabilization buffer and incubated for 5 min before fixation.

    • Bars : (b) 10 I,m; (d) 2.5 um.

Control de la polymérisation de l’actine dans des fibroblastes vivants et perméabilisés


M canisme de la nucl ation

Mécanisme de la nucléation

  • Régulée par des signaux externes

  • Catalysée par un complexe de protéines qui comprend deux Actine Related Proteins (ARPs)


Actin related proteins arps

Actin Related Proteins (ARPs)

  • Catalysent la nucléation de l'actine

  • 2 protéines proche à 45% de l'actine

  • Fonction analogue à -TuRC pour la tubuline

  • Comprend le complexe ARP (= Arp 2/3)

  • Nuclée le filament à partir de l’extrémité –

  • Et allonge rapidement l’extrémité +

  • Peut se fixer latéralement  embranchement


Fig16 28 ab

Fig16-28(AB)

Rôle du complexe ARP dans la nucléation de l'actine


Fig16 28 c

Fig16-28(C)

Rôle du complexe ARP dans la formation du réseau d'actine


Mullins rd1998

Microscopie électronique de complexes Arp2/3 en congélation sublimation et ombrage rotatoire (A) et de complexes mélangés avec des filaments d’actine cappés avec de la gelsoline (B-D).

Mullins,RD1998

Electron micrographs of quick-frozen, deep-etched, and rotary-shadowed samples of Arp2/3 complex (A) and complex mixed with gelsolin-capped actin filaments (B-D). In the presence of Arp2/3, complex actin filaments form branching arbors with numerous end-to-side connections between filaments (B). The branch points appear to be rigid attachments with a fixed 70° angle between actin filaments (C) and frequently contain a globular mass at the point of attachment (C, left arrow in B). (D) Filaments partially decorated with Arp2/3 complex. (E) Globular masses associated with filament pointed ends in the presence of Arp2/3 complex. Conditions: buffer same as Fig. 1


Donn es volutives tubuline et arp

Données évolutives -tubuline et ARP

  • Très anciens

  • Très conservés

  • Duplication du gène codant pour tubuline ou actine avec une fonction de nucléation en plus par divergence et spécialisation


B prot ines de liaison dynamisme du cytosquelette

B – Protéines de liaison  dynamisme du cytosquelette

  • Protéines de liaison aux sous-unités libres

    • Actine

      • Thymosine

      • Profiline

    • Tubuline

      • Stathmine

  • Protéines de liaison latérale

    • Tubuline

      • MAPs

    • Actine

      • Tropomyosine

      • Cofiline

  • Protéines de liaison aux extrémités

    • Actine

    • Tubuline


1 prot ines de liaison aux sous unit s libres

1 - Protéines de liaison aux sous-unités libres

  • Actine

  • Tubuline


A actine

a) Actine

  • Dans une cellule (non musculaire) : 50% actine filamenteuse / 50% actine soluble

  • [Actine] en monomère dans une cellule : 50-200 M (2-8 mg/ml)

  • Cc [Actine] en monomère en tube à essai : <1 M 

  • Pourquoi l’actine soluble ne polymérise-t-elle pas en filaments dans la cellule ?

  • Parce qu’il y a des protéines qui empêchent la polymérisation en se fixant sur les sous-unités


Prot ines de liaison aux sous unit s libres d actine

Protéines de liaison aux sous-unités libres d’actine

Thymosine : la plus abondante

Profiline

Ne peuvent être fixées en même temps


Thymosine

Thymosine

  • Bloque l'actine libre 

  • Qui ne peut s’associer ni au bout + ni au bout -

  • Bloque l'échange et/ou l'hydrolyse de ATP

  • Empêche l'allongement

  • Comment utiliser cette actine séquestrée ?

    • Système de régulation de la thymosine ? non

    • Intervention de la profiline ? oui


Profiline

Profiline

  • Se fixe sur l'extrémité + du monomère à l’opposé de la gorge qui contient l’ATP (extrémité -)

  • Bloque ainsi le côté du monomère qui s’associerait normalement à l’extrémité – du filament

  • Le complexe actine-profiline peut facilement se fixer sur l’extrémité + libre d’un filament.

  • Dès que le complexe actine-profiline est additionné  changement de conformation de l’actine  diminution de l’affinité actine / profiline  profiline part  allongement facilité


R sum thymosine profiline

Résumé thymosine-profiline

  • Thymosine

    • Bloque le monomère partout

  • Profiline

    • Allonge le filament à son bout +

    • « Déséquestre » l’actine de la thymosine


Fig16 29

Fig16-29

Profiline liée à un monomère d'actine

Fixée sur l'extrémité + à l’opposé de la gorge qui contient l’ATP

Peut allonger l’extrémité + du filament

Ne peut pas allonger l’extrémité – du filament

+


Comp tition thymosine profiline

Compétition thymosine – profiline

  • Compétition pour se fixer au monomère d’actine

  • Activation locale de molécules de profiline  libération de l’actine séquestrée par la thymosine


Fig16 30 1

Fig16-30(1)

Résumé : Effets de la thymosine et de la profiline sur la polymérisation de l'actine


Fig16 30 2

Fig16-30(2)

Effets de la thymosine et de la profiline sur la polymérisation de l'actine


R gulation de l activit de la profiline

Régulation de l’activité de la profiline

  • Par phosphorylation

  • Par liaison aux phospholipides inositol (PI)

  • Protéines intra cellulaires avec domaines riches en proline


Sites de r gulation de la profiline

Sites de régulation de la profiline

  • Membrane plasmique

  • Se lie aux phospholipides de la membrane plasmique

  • En relation étroite avec l’extérieur pour faire croître lamellipodes ou filopodes


B tubuline

b) Tubuline

  • C de tubuline libre dans la cellule > Cc [tubuline] en monomère en tube à essais

  • Pourquoi la tubuline soluble ne polymérise-t-elle pas en microtubules dans la cellule ?

  • Parce qu’il y a des protéines qui séquestrent la tubuline libre


La stathmine

La stathmine

  • Se fixe sur deux hétérodimères de tubuline et empêche leur addition aux microtubules

  • Diminue ainsi la concentration de tubuline disponible pour la polymérisation (comme la colchicine)


La stathmine1

La stathmine

  • Taux d’élongation d’un MT = Kon x [tubuline] 

  • Si [tubuline]   taux d’élongation 

  • Or la stathmine  [tubuline] en la séquestrant 

  • Stathmine  taux d’élongation du MT


La stathmine2

La stathmine

  • Le passage de l’état de croissance au désassemblage du microtubule est une course entre l’hydrolyse du GTP et l’allongement du filament 

  • Comme la stathmine  [tubuline] en la séquestrant

  • Stathmine  le désassemblage du microtubule


Fig16 31

Fig16-31

Effets de la stathmine (=oncoprotéine 18) sur la polymérisation des microtubules


R gulation de l activit de la stathmine

Régulation de l’activité de la stathmine

  • Phosphorylation de la stathmine inhibe la fixation à la tubuline 

  • Phosphorylation de la stathmine

    •  taux d’élongation du microtubule

    •  le désassemblage du microtubule (suppression de l’instabilité dynamique)


2 prot ines de liaison lat rale

2 - Protéines de liaison latérale

Protéines qui se fixent le long du polymère pour le stabiliser ou le déstabiliser

  • Tubuline

  • Actine


A prot ines de liaison lat rale tubuline

a) Protéines de liaison latérale : tubuline

Les Microtubules Associated Proteins (MAPs) = protéines liées le long des microtubules (par définition)

Peuvent stabiliser les microtubules contre le désassemblage (comme le taxol)

Interaction des microtubules avec les autres composants de la cellule

Forment la structure de base des axones et dendrites


Fig16 32

Fig16-32

Localisation des MAPs dans les axones et les dendrites

Protéine  (vert)axone (ramifié)

MAP 2corps cellulaire et dendrites

10 m


Deux domaines aux maps

Deux domaines aux MAPs

  • Un domaine lié au microtubule

  • Un domaine qui se projette en dehorsdont la longueur conditionne le degré d’empaquetage des microtubules

    • MAP 2 : long domaine externefaisceaux de microtubules espacés

    • Protéines  : domaine externe courtfaisceaux de microtubules compacts


Fig16 33

Fig16-33

Organisation des faisceaux de MT par les MAPs

Cellule surexprimant MAP2

Cellule surexprimant tau


Biochimie des maps dont tau et map2

Biochimie des MAPS (dont tau et MAP2)

  • Nombreuses copies d’un motif de liaison à la tubuline

  • Ces MAPs + tubuline pure non polymérisée  nucléation  par stabilisation des premiers oligomères de tubuline

  • Cibles de plusieurs protéine kinases


Le cytosquelette

MAPs

  • MAP2 et tau

    • Localisées dans certains types de cellules des vertébrés

  • Autres MAPs

    • Rôle central dans la dynamique des microtubules chez presque tous les eucaryotes

    • XMAP215


Xmap215

XMAP215

  • Xenopusmicrotubule associated protein (masse molaire=215)

  • Ubiquitaire

  • De la levure à l’homme

  • Se lie le long des microtubules (devrait être dans §3)

  • Capacité particulière à stabiliser les extrémités libres des microtubules

  • Inhibe le passage de croissance à raccourcissement des microtubules

  • Pendant la mitose il y a phosphorylation de XMAP215  inhibition de cette activité  augmentation 10X de instabilité des microtubules


Fig 18 12 a

Fig.18-12 A


Fig 18 12 b

Fig.18-12 B

  • Pendant la mitose, phosphorylation de XMAP215 

  • Activité inhibée 

  • Instabilité dynamique des microtubules pendant la mitose multipliée par 10


B prot ines de liaison lat rale actine

b) Protéines de liaison latérale : actine

  • Tropomyosine

  • Cofiline (=actine depolymerising factor)


Tropomyosine

Tropomyosine

  • Dans la plupart des cellules (pas que dans les cellules musculaires)

  • Se lie à 7 sous-unités adjacentes d’actine dans le filament

  • Empêche l’interaction avec d’autres protéines

  • Rôle dans la contraction musculaire


Fig 16 74

Fig.16-74


Cofiline actine depolymerizing factor

Cofiline(=actine depolymerizing factor)

  • Déstabilise le filament d’actine

  • Peut se lier à la fois sur l’actine et sur le filament (inhabituel)

  • Force le filament à s’enrouler plus serré  affaiblit les contacts entre les sous-unités d’actine du filament  filament plus cassant


Fig16 34

Fig16-34

Modification de la morphologie du filament d'actine par la cofiline

Filament plus court et plus épais


M canisme d action 1 2

Mécanisme d’action 1/2

  • Facilite la dissociation d’une sous-unité d’actine-ADP à l’extrémité moins du filament

  • Or c’est la lenteur de la dissociation à l’extrémité – qui limite le tapis roulant du filament 

  • La liaison à la cofiline  accélération du tapis roulant 

  • Le durée de vie des filaments dans la cellule est beaucoup plus courte que de l’actine pure en tube à essais


M canisme d action 2 2

Mécanisme d’action 2/2

  • La cofiline préfère se lier à des filaments contenant de l’actine-ADP plutôt que de l’actine-ATP

  • Or l’hydrolyse de l’ATP est plus lente que l’assemblage du filament 

  • Les nouveaux filaments contiennent surtout de l’ATP-actine 

  • La cofiline déstabilise plus les anciens filaments que les nouveaux 

  • Accélère le turn over des filaments


3 prot ines de liaison aux extr mit s du filament

3 - Protéines de liaison aux extrémités du filament

  • Actine

  • Tubuline


Justification de ces prot ines

Justification de ces protéines

  • Protéines de liaison latérale (§ 2)

    • Modifient la dynamique du filament

    • Mais il en faut beaucoup (doit recouvrir tout le filament)

      • 1 tropomyosine pour 7 actines

      • 1 tau pour 4 tubulines

      • 1 cofiline pour 1 actine

  • Protéines de liaison aux extrémités du filament (§ 3)

    • Modifient la dynamique du filament

    • Mais peuvent être en très faible quantité

      • 1 molécule par « filament » suffit (eg 1molécule pour 200-500 actines)


A prot ines de liaison aux extr mit s du filament actine

a) Protéines de liaison aux extrémités du filament : actine

Protéines « cappantes »

« cap » l’extrémité + du filament où ont lieu les changements les plus rapides du filament une fois que l’ATP de l’extrémité s’est transformée en ADP 

Ralentit considérablement les vitesses d’allongement et de raccourcissement du filament en rendant l’extrémité + inactive


Fig16 35

Fig16-35

Effet du capping des filaments (actine et pas tubuline) sur leur dynamique


Prot ines cappantes

Protéines cappantes

  • La plupart des filaments sont « capés » à leur extrémité +

  • eg : protéine CapZ (strie Z du muscle)

  • Complexe ARP à l’extrémité – d’un filament (celui qui a permis la nucléation)


R gulation du capping

Régulation du « capping »

  • Régulation locale pour adapter le cytosquelette

  • Signaux intra cellulaires

  • PIP2 (phosphatidyl Inositol-2 Phosphate) régule les protéines qui « cappent » l’extrémité +

    •  de PIP2 dans le feuillet cytosolique  dé « cappe » l’extrémité +  allongement  polymérisation en surface

  • Dans les cellules musculaires durée de vie très longue des filaments d’actine

    • CapZ au bout +

    • Tropomoduline au bout –

    • (+ Tropomysine tout le long pour stabiliser)


  • B prot ines de liaison aux extr mit s du filament microtubule

    b) Protéines de liaison aux extrémités du filament : microtubule

    Beaucoup plus compliqué

    13 protofilaments

    Tube creux

    Rôle dans la dynamique des microtubules

    Rôle dans le contrôle du positionnement des microtubules


    Prot ines de liaison aux extr mit s du microtubule

    Protéines de liaison aux extrémités du microtubule

    • -tubuline ring complex

    • Complexe protéique spécial qu’on trouve aux extrémités des microtubules des cils (cf. infra)

    • Catastrophines

    • MAPs


    I tubuline ring complex d j vu

    i - -tubuline ring complex (déjà vu)

    • Nuclée le microtubule

    • « Cap » l’extrémité –


    Ii complexe prot ique sp cial qu on trouve aux extr mit s des microtubules des cils cf infra

    ii - Complexe protéique spécial qu’on trouve aux extrémités des microtubules des cils (cf. infra)


    Iii catastrophines

    iii. Catastrophines

    • Jouent sur la fréquence des « catastrophes »

    • Tendent à effilocher l’extrémité du filament

    • Appartiennent à la superfamille des kinésines

    • Synonyme : famille Kin 1 (qui comprend KIF2 cf. moteurs infra)


    Iv maps

    iv. MAPs

    • Action inverse : tendent à favoriser la croissance


    Fig16 36 a

    Fig16-36(A)

    Effets de la liaison de protéines aux extrémités


    R gulation des prot ines de liaison aux extr mit s du microtubule

    Régulation des protéines de liaison aux extrémités du microtubule

    • Toutes ces protéines sont régulées

    • C’est ce qui se passe à la mitose


    Fig 18 12 a1

    Fig.18-12 A


    Fig 18 12 b1

    Fig.18-12 B

    • Pendant la mitose, phosphorylation de XMAP215 

    • Activité inhibée 

    • Instabilité dynamique des microtubules pendant la mitose multipliée par 10


    R le dans le contr le du positionnement des microtubules

    Rôle dans le contrôle du positionnement des microtubules

    • A l’extrémité – : -tubuline ring complex

    • A l’extrémité + : protéines de localisation des microtubules dans le cortex cellulaire

      • eg :


    Fig16 36 b

    Fig16-36(B)

    Conséquences de la liaison de protéines aux extrémités des microtubules

    EB1 = protéine cappante de MT (existe chez l’homme)

    Kar9 = protéine localisée vers la membrane

    Permet aux MT du fuseau de se diriger dans le bourgeon de croissance pendant la mitose


    C organisation d ordre sup rieur cross linking

    C - Organisation d'ordre supérieur (cross linking)

    Les protéines vues ci-dessus interviennent dans le dynamisme

    Il faut aussi stabiliser, assurer l’intégrité mécanique, forme

    Centrosome (nucléation, orientation des microtubules, milieu de la cellule…)

    MAPs

    Tropomyosine …


    Diff rentes organisations faisant appel au cross linking

    Différentes organisations faisant appel au cross linking

    • Filaments intermédiaires

      • Association latérale des filaments entre eux

      • Protéines accessoires

    • Actine

      • Deux types de protéines (tropomyosine pour stabilisation + autres protéines pour le cross linking)

    • Microtubules

      • MAPs ont deux domaines (MT, extérieur)


    Diff rentes organisations faisant appel au cross linking1

    Différentes organisations faisant appel au cross linking

    • Filaments intermédiaires

    • Les différents types d’organisation des filaments d’actine

    • Effets de la fragmentation des filaments sur leur dynamique

      • Microtubules : catanine

      • Actine : gelsoline

    • Exemple : activation des plaquettes


    1 filaments interm diaires

    1 - Filaments intermédiaires


    Organisation du r seau de filaments interm diaires

    Organisation du réseau de filaments intermédiaires

    Structure du filament  robustesse

    Protéine NF-M et NF-H ont un domaine C-terminal qui forme une projection qui se lie aux FI voisins

    Filagrine : permet le maintien des faisceaux de FI de kératine

    Plectine : nombreuses propriétés


    Plectine

    Plectine

    • Permet le maintien des faisceaux de vimentine

    • Lie les faisceaux de FI (vimentine) aux

      • Microtubules

      • Filaments d’actine

      • Myosine II

      • Membrane plasmique


    Fig16 37

    Fig16-37

    Liaison des filaments intermédiaires aux filaments intermédiaires

    Liaison des filaments intermédiaires aux microtubules

    Liaison des filaments intermédiaires aux filaments épais de myosine

    Grâce à la plectine (anticorps marqués à l'or)

    Plectine

    FI

    MT

    Cross linking de la plectine aux différents éléments du cytosquelette


    Mutations dans le g ne de la plectine

    Mutations dans le gène de la plectine

    • Maladie très grave

      • Épidermolyse bulleuse (filaments de kératine)

      • Dystrophie musculaire (filaments de desmine)

      • Dégénérescence nerveuse (neurofilaments)

    • Chez la souris

      • Mort en quelques jours

      • Phlyctènes de la peau

      • Atteintes musculaire et cardiaque


    2 diff rents types d organisation des filaments d actine

    2 - Différents types d'organisation des filaments d'actine

    Faisceau de filaments

    Gel


    Fig16 38

    Fig16-38

    Organisation des filaments d'actine

    Fibres de stress(tension)

    Exploration de l’environnement


    2 types de prot ines cross linking

     2 types de protéines cross linking

    • Protéines formant les faisceaux

      • Filaments parallèles

      • Connexion rigide entre les deux domaines de liaison à l’actine

    • Protéines formant un gel ou un réseau

      • Filaments à grand angle

      • Connexion à courbe rigide ou flexible

        Les deux ont deux sites identiques de liaison aux filaments d’actine (monomère ou dimère)


    Fig16 39

    Fig16-39

    Quatre exemples de protéines de liaison à l'actine

    Deux sites de liaison à l'actine (avec séquence proche)


    Exemples de prot ines cross linking

    Exemples de protéines cross linking

    • Faisceau

    • Gel ou réseau


    Faisceau

    Faisceau

    • Fimbrine

      • 14 nm entre deux filaments

      • Localisation dans les filopodes et bord avant

      • Microvillosité

    • -actinine

      • 30 nm entre deux filaments (plus lâche)

      • Fibres de stress

      • Contacts focaux

    • Villine

      • Deux sites proches de liaison à l’actine ( fimbrine)

      • Microvillosité

      • Même famille que la gelsoline (cf. infra)


    Gel ou r seau

    Gel ou réseau

    • Filamine

      • liaison en V  filaments à angle droit

    • Spectrine

      • 200 nm

      • Forme un réseau

    • Les protéines cross linking déterminent le type de structure d’actine…


    Fig16 40

    Fig16-40

    Formation de deux types de faisceaux d'actine

    -Actinine purifiée


    Les prot ines cross linking d terminent le type de structure d actine

    … Les protéines cross linking déterminent le type de structure d’actine…

    • …et donc le type des autres molécules qui vont interagir

    • -actinine  myosine II  fibres de stress contractiles

    • Fimbrine  exclut la myosine  les filopodes ne sont pas contractiles

    • Villine   fimbrine


    Microvillosit

    Microvillosité

    • Extension en doigt de gant de la membrane plasmique des cellules épithéliales

    • 0,08 m x 1 m

    • Cellules à fonction d’absorption

    • Augmente la surface d’absorption x20

    • Entérocyte : plusieurs milliers de microvillosités au pôle apical

    • 20 – 30 filaments d’actine en faisceau

    • Fimbrine + actine

    • Fibroblaste injecté de villine  microvillosité plus longues et plus nombreuses

    • Bras latéraux de myosine I entre le faisceau d’actine et les lipides de la membrane plasmique


    Fig16 41 a

    Fig16-41(A)

    Microvillosité

    • Extension en doigt de gant de la membrane plasmique des cellules épithéliales

    • 0,08 m x 1 m

    • Cellules à fonction d’absorption

    • Augmente la surface d’absorption x20

    • Entérocyte : plusieurs milliers de microvillosités au pôle apical

    • 20 – 30 filaments d’actine en faisceau

    • Fimbrine + villine

    • Fibroblaste injecté de villine  microvillosité plus longues et plus nombreuses

    • Bras latéraux de myosine I entre le faisceau d’actine et les lipides de la membrane plasmique


    Fig16 41 bc

    Fig16-41(BC)

    Microvillosité (cryofracture)

    Contient spectrine et myosine II

    Au-dessous : couche de filaments intermédiaires


    Le cytosquelette

    Karl R. Fath and David R. Burgess Microvillus Assembly: Not actin alone Current Biology Volume 5, Issue 6 , June 1995, Pages 591-593

    Fig. 1. A summary of the main events that correlate with the localization of the major actin-binding proteins to the microvilli during brush border formation. Three stages in the assembly of microvilli and the terminal web in the apical cytoplasm of a developing chicken enterocyte are illustrated. (a) Early membrane projections expressing both ezrin and villin contain several actin filaments lying near the membrane. (b) Later, as the microvillus elongates, the number of actin filaments increases and myosin-l links the core filaments with the microvillus membrane. Both plasma membrane and myosinmay be supplied to the microvillus by Golgi-derived vesicles. (c) Coincident with the appearance of fimbrin, the number and length of the actin filaments increases and the core filaments become hexagonally packed.


    Formation de r seau spectrine

    Formation de réseau : spectrine

    • Conditionne la formation d’un réseau

    • Identifiée pour la première fois dans les globules rouges

    • Protéine longue et flexible

    • 4 chaînes polypeptidiques (Deux  et deux )

    • Les sites d’actine sont séparés de 200 nm

    • Réseau à 2-D maintenu par de l’actine sous la membrane plasmique dans le globule rouge

    • Protéines membranaires


    Fig 10 31

    Fig 10-31


    Globule rouge

    Globule rouge

    • Cortex cellulaire rigide

    • Reprise de la forme du globule rouge après passage dans un capillaire

    • Équivalents de spectrine dans le cortex des autres types cellulaires des vertébrés


    Formation d un gel filamine

    Formation d’un gel : filamine

    • Servent dans les lamellipodes qui permettent à la cellule de ramper sur un support


    Fig16 42

    Fig16-42

    Formation d'un gel (3-D) par la filamine


    Fig16 43

    Fig16-43

    Cellules de mélanome

    Peu de filamine (mobilité anormale)

    Pas de lamellipodes

    Bulles anormales à la surface

    Peu de déplacement

    Pas de métastase

    Restauration artificielle de la filamine

    Lamellipodes

    Hautement métastasiante


    3 effets de la fragmentation des filaments sur leur dynamique

    3 - Effets de la fragmentation des filaments sur leur dynamique

    • Cassure d’un filament (en des douzaines de fragments)  nombre d’extrémités + et – 

      • Sous certaines conditions :  des sites de nucléation et  allongement

      • Sous d’autres conditions: dépolymérisation des vieux filaments 

      • Changement des propriétés physiques et mécaniques du cytoplasme

      • Les faisceaux et gels deviennent plus fluides


    Fig16 44

    Fig16-44

    Effets de la fragmentation des filaments sur leur dynamique


    Intervention de prot ines cassantes sur la longueur et la dynamique des mf et microtubules

    Intervention de protéines cassantes sur la longueur et la dynamique des MF et microtubules

    Microtubules

    Katanine

    Actine

    Gelsoline


    A microtubules katanine

    a - Microtubules : katanine

    • « épée » en japonais

    • Peut casser les 13 protofilaments d’un microtubule

    • Deux sous-unités

      • Petite : hydrolyse ATP + casse le protofilament

      • Grosse : dirige la katanine vers le centrosome


    R le de la katanine

    Rôle de la katanine

    • Libère les microtubules de leur point d’attache à un centre organisateur de microtubules

    • Applications

      • Dépolymérisation rapide des microtubules aux pôles du fuseau à la mitose

      • Cellules en prolifération

      • Neurones


    Fig16 45

    Fig16-45

    Cassure des microtubules par la katanine

    30 s après l'addition de Katanine

    Même champ 3 minutes après l'addition de la Katanine

    MT marqués par la rhodamine et stabilisés par le taxol adsorbés sur une plaque de verre


    B microfilaments d actine gelsoline

    b - Microfilaments d’actine : gelsoline

    • Superfamille des gelsolines

    • Peut casser le filament d’actine

    • Activité activée par une forte [Ca++]cytosolique

    • Ne nécessite pas d’ATP


    Gelsoline

    Gelsoline

    • Possède des sous-domaines dont deux sites

    • Qui se lient à deux sites différents de la sous-unité d’actine

      • Un à la surface du filament

      • Un caché dans la liaison avec la sous-unité suivante


    Mode d action pr sum de la gelsoline

    Mode d’action présumé de la gelsoline

    • Liaison sur le côté d’un filament d’actine par un des 2 sites de liaison de la gelsoline à l’actine

    • Fluctuation thermique  fente entre des sous-unités voisines du protofilament d’actine

    • Infiltration de la gelsoline dans la fente 

    • Cassure du filament

    • « Capping » de la gelsoline à l’extrémité du filament par son 2ème site de fixation à l’actine

    • Peut être retirée du filament par une augmentation de PIP2


    Fig16 46

    Fig16-46

    Modèle de cassure du filament d'actine par la gelsoline


    4 application activation des plaquettes

    4 - Application : activation des plaquettes

    • Très bel exemple de

    • Régulation des protéines accessoires à l’actine

    • Cassure, « capping », cross linking 

    • Grosses modifications morphologiques


    Plaquette au repos

    Plaquette au repos

    • Circule dans le sang

    • Pas de noyau

    • Forment le caillot

    • Forme discoïde

    • Actine sous forme de filaments courts

    • « Cappés » par CapZ

    • Beaucoup de monomères d’actine liés à la profiline


    Activation de la plaquette

    Activation de la plaquette

    • Par contact physique avec un vaisseau endommagé

    • Ou agent chimique comme la thrombine


    M canisme de l activation

    Mécanisme de l’activation

    • Cascade de signalisation intra cellulaire 

      • Afflux massif de Ca++ dans le cytosol

      • Ca++active gelsoline

      • Gelsoline casse et « cap » les filaments en filaments plus petits

      • Qui sont maintenant « cappés » de gelsoline

    • Cascade de signalisation intra cellulaire 

      •  de PIP2 

      • Inactivation de gelsoline et CapZ

      • Qui sont retirées toutes les deux 


    M canisme de l activation1

    Mécanisme de l’activation

    • Augmentation du nombre d’extrémités libres

    • Qui sont rapidement allongés par les nombreuses sous-unités libres d’actine 

    • Nombreux filaments longs


    Intervention des autres prot ines de liaison l actine

    Intervention des autres protéines de liaison à l’actine

    • Ces nombreux filaments longs sont transformés en gel par la gelsoline

    • D’autres sont transformés en faisceaux par -actinine et fimbrine


    Fin de l activation de la plaquette

    Fin de l’activation de la plaquette

    • Formation de lamellipodes et filopodes pour recouvrir le caillot

    • Et fixation des plaquettes au caillot par des intégrines


    Retour au repos

    Retour au repos

    • Le signal PIP2 s’affaisse

    • CapZ retourne aux extrémités des filaments

    • Les filaments redeviennent stables

    • Les plaquettes reprennent leur forme étalée

    • Myosine II hydrolyse de l’ATP pour glisse le long des filaments d’actine les uns par rapport aux autres 

    • Contraction de la plaquette qui rapproche les berges de la plaie


    Fig16 47 a

    Fig16-47(A)

    Activation plaquettaire


    Fig16 47 bcd

    Fig16-47(BCD)

    Activation plaquettaire

    Avant l’activation Plaquette activée Après contractionde la myosine II


    D fixation des l ments du cytosquelette la membrane plasmique

    D - Fixation des éléments du cytosquelette à la membrane plasmique

    Rôle du cytosquelette dans la forme et la rigidité de la membrane plasmique de la cellule

    Cortex du GR : réseau actine + spectrine

    Microvillosité : faisceau actine + villine

    Deux facteurs dans le maintien de ces structures

    Maintien des filaments d’actine en faisceau et cross linking des filaments

    Fixation spécifique des filaments d’actine aux protéines ou lipides de la membrane plasmique

    De plus connexion des structures internes de la cellule à son environnement

    Autres cellules

    Matrice extra cellulaire


    Continuum entre l int rieur et l ext rieur de la cellule

    Continuum entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule

    • Éléments du cytosol>< Actine et filaments intermédiaires >< protéines transmembranaires  adhésion cellulaire

    • Cf. chapitre matrice extra cellulaire pour connexions membrane  matrice extra cellulaire


    Famille erm ez rine radixine mo sine

    Famille ERM (Ezérine – Radixine – Moésine)

    • Protéines intra cellulaires proches les unes des autres

    • Attachent les filaments d’actine à la membrane plasmique

      • Extrémité – C de la protéine se lie directement au filament d’actine

      • Extrémité - N de la protéine se lie à la face cytoplasmique de glycoprotéines trans-membranaires dont CD44 (récepteur à l’acide hyaluronique)


    Neurofibromatose

    Neurofibromatose

    • Maladie génétique

    • Tumeurs nerveuses bénignes multiples

    • Mutations dans les protéines ERM

    • Mutation  perte d’une protéine (appelée merline) de la famille ERM


    Le cytosquelette

    GENES & DEVELOPMENT 19:2265-2277, 2005 REVIEWMembrane organization and tumorigenesis—the NF2 tumor suppressor, Merlin Andrea I. McClatchey and Marco Giovannini

    • Merlin-organized complexes prevent mitogenic signaling and contact-dependent inhibition of proliferation. (Left) At low cell density in cell culture, Merlin is predominantly hyperphosphorylated and inactive and mitogenic signaling proceeds. Similarly, upon cell reattachment to certain ECM substrates, a pool of Merlin is rapidly phosphorylated. (Right) At high cell density in cell culture, Merlin is hypophosphorylated, self-associated, and active in mediating contact-dependent inhibition of proliferation. Merlin is recruited to nascent cell:cell boundaries where it appears to stabilize AJs between cells, perhaps by inhibiting Rac/Pak signaling and/or stabilizing the actin cytoskeleton. Under these conditions, Merlin may inhibit signaling from AJ-associated growth-factor receptors. Hypophosphorylated Merlin can also interact with cell:ECM receptors such as CD44, which binds to hyaluronic acid (HA); increased CD44:HA interaction with increased cell density leads to high levels of active Merlin, which may inhibit associated growth-factor receptors. Notably, complete cell detachment also leads to hypophosphorylation and activation of Merlin. Perhaps inhibited mitogenic signaling from multiple complexes accumulates, reaching a threshold that halts proliferation. The study and manipulation of cell:cell contact in two dimensions in cell culture is nonphysiological; in vivo cells in a tissue are contacting other cells and can override contact-dependent inhibition of proliferation under certain normal conditions or in the context of a tumor. Merlin may coordinate the receipt of physical information from the extracellular milieu with the receipt and processing of mitogenic stimuli.


    R gulation des prot ines d attachement des filaments d actine la membrane plasmique

    Régulation des protéines d’attachement des filaments d’actine à la membrane plasmique

    • Spectrine ou myosine I  régulation par des signaux intra cellulaires

    • Protéines ERM  régulation par des signaux intra et extra cellulaires


    Les deux conformations des prot ines erm

    Les deux conformations des protéines ERM

    • Conformation déroulée active : oligomérise et se lie à l’actine et à CD44

    • Conformation repliée inactive : les extrémités N – et C – terminales sont liées entre-elles

    • Passage d’une conformation à l’autre

      • Phosphorylation

      • Liaison à PIP2

        En réponse à des signaux extra cellulaires


    Fig16 48

    Fig16-48

    Rôle des protéines de la famille ERM dans l'attachement des filaments d'actine à la membrane plasmique

    (ezrine, radixine, moésine)


    Rapport du cytosquelette avec les jonctions cellulaires

    Rapport du cytosquelette avec les jonctions cellulaires

    Cytosquelette  matrice extra cellulaire

    Cytosquelette  cellule voisine


    1 cytosquelette matrice extra cellulaire contacts focaux

    1 - Cytosquelette  matrice extra cellulaire : contacts focaux

    • Terminaison à leur niveau des fibres de stress constituées de faisceaux d’actine et myosine II

    • Présence d’intégrines à leur niveau

    • Intégrines (cf chapitre MEC)

      • Protéines d’adhésion trans-membranaire

      • Se lient indirectement aux faisceaux d’actine


    Fonctions des contacts focaux

    Fonctions des contacts focaux

    • Permet à la cellule de tirer sur son support : via fibres de stress

    • Relais de signaux de la matrice extra cellulaire vers le cytosol : via FAK


    Focal adhesion kinase fak

    Focal Adhesion Kinase (FAK)

    • C’est une tyrosine kinase

    • Activée par l’agrégation des intégrines des contacts focaux

    • Sensible au substrat de la cellule et la force de tension : comment ??

    • Cible de la Src tyrosine kinase cytoplasmique

    • Phosphoryle de nombreuse cibles  régule survie, croissance, prolifération, morphologie, mouvement, différenciation des cellules en réponse à l’environnement


    Fig16 49

    Fig16-49

    Contacts focaux et fibres de stress dans un fibroblaste en culture

    Microscopie à contraste interférentiel

    Anticorps anti-actine


    2 cytosquelette cellule voisine cadh rines

    2 - Cytosquelette  cellule voisine: cadhérines

    • Protéines trans-membranaires

    • Queue cytoplasmique se lient aux caténines qui se lient à l’actine

    • Jonctions adhérentes = amas de contacts cellules-cellules à cadhérine-actine


    Fig 19 24 a b

    Fig 19-24 A-B

    • Molécule de cadhérine


    Fig 19 24 c

    Fig 19-24 C


    Autres structures cytosquelette cellule voisine desmosomes et h midesmosomes

    Autres structures cytosquelette  cellule voisine : desmosomes et hémidesmosomes

    • Filaments intermédiaires – membrane plasmique

    • Desmosomes : cellules - cellules

    • Hémidesmosomes : cellules - matrice


    Retentissement des signaux extra cellulaires sur le cytosquelette deux cibles

    Retentissement des signaux extra cellulaires sur le cytosquelette : deux cibles

    Protéines associées aux éléments du cytosquelette

    Longueur, localisation , organisation dynamique

    Signal extra cellulaire  cytosquelette via protéines accessoires

    GTPases monomériques membres de la famille des protéine Rho*

    À l’intérieur de la cellule

    Cible de nombreux récepteurs membranaires

    * (ne pas confondre avec Rab  amarrage des protéines de transport


    Famille des prot ines rho

    Famille des protéines Rho

    • Rho GTP-Binding Proteins

      • Une grande famille de protéines monomériques de liaison au GTP impliquée

        • Dans la régulation de l’organisation de l’actine

        • L’expression des gènes

        • Et la progression du cycle cellulaire

    • This enzyme was formerly listed as EC 3.6.1.47. Year introduced: 2000


    Rho signalling at a glance j cell sci 117 5457 5458 2004 martin schwartz

    Rho signalling at a glance J. Cell Sci 117, 5457-5458 (2004)Martin Schwartz

    • Cells receive extracellular stimuli in the form of soluble molecules(growth factors, cytokines and hormones) that bind to cell surfacereceptors, adhesive interactions (extracellular matrix and cell-celladhesion) or mechanical stresses (tension, compression and fluidshear stress). These stimuli act upon guanine-nucleotide-exchangefactors (GEFs) and GTPase-activating proteins (GAPs) to controlthe activation state of the small GTPases Rho, Rac and Cdc42.Once activated, the GTPases bind to a spectrum of effectorsto stimulate downstream signaling pathways. The pathways shownin the poster represent the major effector pathways for theseRho family GTPases. The total number of effectors is too largeto be shown here, and I apologize to authors whose work couldnot be included. [Excellent reviews for these effector pathwaysare available; for detailed information, please see (Bishopand Hall, 2000; Symons and Settleman, 2000; Bokoch, 2003; Ridley,2001; Yoshimi et al., 2001; Riento and Ridley, 2003).] OtherRho family proteins are not included but readers are referredto a recent review (Wennerberg and Der, 2004).

    • Protein kinase N1 (PKN1, also known as PRK) and PKN2 are Rhoeffectors involved in endosomal trafficking. Citron is a ROCK-relatedkinase that is critical for cytokinesis and is also implicatedin other aspects of cell cycle progression. Mammalian diaphanousprotein 1 (mDia1, also known as dia-related formin or DRF),mDia2 and mDia3 mediate both actin polymerization through aprofilin-dependent mechanism and stabilization of microtubuleplus ends in cell migration.

    • Rho kinase 1 (also known as ROCK1) and ROCK2 are key Rho effectorsthat have multiple substrates. A partial list includes the myosin-bindingsubunit of the myosin phosphatase (MBS), which leads to inhibitionof phosphatase activity, increased myosin light chain phosphorylationand hence increased tension generation; LIM kinase (LIMK), whichphosphorylates cofilin to release actin monomers and promoteactin polymerization; and myosin regulatory light chain itself,which again promotes contractility. Rho kinase phosphorylatesezrin-radixin-moesin (ERM) family proteins to activate theirfunction as linkers between actin and the plasma membrane. Rhokinases also phosphorylate the Na/H+ antiporter NHE-1 to promoteactin-membrane interactions and several intermediate filamentproteins (desmin, vimentin and glial fibrillary acidic protein)to regulate intermediate filament structure.

    • Both Rac and Rho bind to phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase(PIP5K); activation of PIP5K by Rho also requires Rho kinases.Production of phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2]contributes to the activation of ERM proteins and to actin polymerizationthrough WASP, profilin and multiple actin-capping proteins.Other reported substrates for Rho kinases that are not picturedinclude MARCKS, EF-1, calponin, CPI-17 and collapsin-responsemediator protein 2.

    • Rac has numerous effectors that mediate effects on the cytoskeletonand gene expression. Rac binds p67 PHOX to increase activationof the NADPH oxidase system and production of reactive oxygenspecies (ROS), which mediate activation of NF-B-dependent geneexpression, effects of Rac on cell cycle progression and inhibitionof Rho activity. Rac binds the WAVE complex (also containingAbi and IRSp53/58), to release active WAVE, which promotes actinpolymerization in lamellipodia through activation of the Arp2/3complex. Both Rac and Cdc42 bind and activate the kinases PAK1,PAK2 and PAK3. PAKs have multiple substrates, including LIMkinase, which leads to actin polymerization; OP18/stathmin,which stabilizes microtubule plus ends; and Raf-1 and MEK1,whose phosphorylation by PAK enhances transmission of the signalto ERK. PAK activity also regulates myosin phosphorylation andcell contractility through several pathways, including myosinlight chain kinase, myosin regulatory light chain, myosin heavychain and caldesmon. Other pathways not listed on the diagraminclude filamin A, which cooperates with PAK to promote membraneruffling; components of the paxillin-GIT/PKL-P1X complex, whichregulates cell adhesion and motility; and the apoptotic regulatorBAD, which promotes cell survival.

    • Rac and Cdc42 are important activators of Jun N-terminal kinase(JNK) and p38, which stimulate AP-1-dependent gene expression.Mixed lineage kinases (MLKs) appear to be the major Rac/Cdc42effectors leading to JNK and p38 activity. Rac and Cdc42 alsobind to the actin-binding protein IQGAP, which is implicatedin regulation of cell-cell adhesion. Both Rac and Cdc42 alsobind and stimulate PI 3-kinase. The resultant 3'-phosphorylatedlipids bind to and stimulate Rac GEFs, creating a positive feedbackloop that maintains cell migration.

    • WASP (and the more widely expressed N-WASP) are critical downstreameffectors of Cdc42 that mediate formation of filopodia. Theseeffectors also require PtdIns(4,5)P2 and interact directly withArp2/3 complex to promote actin polymerization. Cdc42 activatesthe serine/threonine kinase MRCK, which is related to Rho kinasesand can promote myosin phosphorylation. Cdc42 also activatesthe tyrosine kinases ACK1 and ACK2; the latter regulates focaladhesion formation and organization of the actin cytoskeleton.Cdc42 promotes oncogenic transformation in part by binding tothe and coatamer proteins and regulating membrane trafficking.Finally, Cdc42 is the critical determinant of polarity in awide variety of developmental systems; this involves bindingof Cdc42 to PAR6. PAR6 is a component of a complex containingPAR3 and atypical protein kinase C (PKC or PKC). This complexregulates positioning of the microtubule-organizing center (MTOC)in migrating cells and early embryos, and tight junction formationin epithelia. Borg proteins are Cdc42 effectors that connectto septins, structural proteins that can polymerize to formfilaments involved in cytokinesis in yeast and mammalian cells,and that probably carry out additional structural roles in mammaliancells as well (Joberty et al., 2001).

    • Finally, the poster displays some of the major feedback loopsamong Rho GTPases and their effector pathways. Formation ofintegrin-dependent cell-ECM adhesion formation, cadherin-dependentcell-cell adhesion formation and PI 3-kinase activation influencethe function of GEFs and GAPs for Rho family GTPases. Thesepositive and negative regulatory loops appear to be importantfor cell motility and perhaps other processes.


    Famille des prot ines rho1

    Famille des protéines Rho

    • Appartiennent à la super famille Ras

    • 3 membres de la famille GTPases

      • Cdc42 : active WASp

      • Rac : active WASp (dans sa forme GTP)

      • Rho

    • Agissent comme des interrupteurs moléculaires

      • Actif : liaison au GTP

      • Inactif : liaison au GDP


    Fig 3 70

    Fig. 3-70


    Etienne manneville s2002p629

    Etienne-Manneville,S2002p629

    Le cycle de la GTPase Rho

    • Figure 1 The Rho GTPase cycle. Twenty mammalian Rho GTPases have been described:

    • Rho (three isoforms: A, B, C);

    • Rac (1, 2, 3); Cdc42; TC10; TCL; Chp (1, 2); RhoG; Rnd (1, 2, 3); RhoBTB (1, 2); RhoD; Rif; and TTF.

    • They cycle between an active (GTP-bound) and an inactive (GDP-bound) conformation. In the active state, they interact with one of over 60 target proteins (effectors). The cycle is highly regulated by three classes of protein: in mammalian cells, around 60 guanine nucleotide exchange factors (GEFs) catalyse nucleotide exchange and mediate activation; more than 70 GTPase-activating proteins (GAPs) stimulate GTP hydrolysis, leading to inactivation; and four guanine nucleotide exchange inhibitors (GDIs) extract the inactive GTPase from membranes. All Rho GTPases are prenylated at their C terminus, and this is required for function. Rnd proteins are exceptional in that they do not hydrolyse GTP in vitro, which is an unusual property for a regulatory GTPase. It has been argued that they are controlled by expression, but it is equally possible that a yet to be identified GAP is required for hydrolysis.

    GDI : guanine nucleotide exchange inhibitors


    1 cdc42

    1 - Cdc42

    • Active WASp


    2 rac gtp

    2 - Rac-GTP

    • Active WASp

    • Active PI(4)P-5 kinase 

    • Génère PI(4,5)P2 

    • Dé - « capping »  des filaments dont l’extrémité + est liée à la gelsoline ou CapZ 

    • Plus de sites d’assemblage à l’actine près de la membrane plasmique 

    • Lamellipodes et ondulations


    3 rho gtp

    3 - Rho-GTP

    • Active une protéine kinase qui inhibe une phosphatase qui agit sur les chaînes légères de myosine 

    • Augmentation des chaînes légères de myosine phosphorylées 

    • Augmentation de l’activité contractile de la myosine 

    • Augmentation des fibres de stress


    Fig 16 67 a

    Fig 16-67 A

    • Illustration


    Fig 16 67 b

    Fig 16-67 B

    • Coloration négative en microscopie électronique de filaments de myosine II (plus courts que ceux que l’on trouve dans la cellule musculaire striée) assemblés in vitro par phosphorylation de leurs chaînes légères


    Membres de la famille wasp

    Membres de la famille WASp

    • Conformation inactive repliée / active dépliée (comme ERM)

    • Protéine WASp + cdc 42-GTP  stabilisation de la forme ouverte  liaison à ARP   de l’activité de nucléation du complexe ARP

    • Nucléation de l’actine


    Dynamique et organisation de l actine

    Dynamique et organisation de l’actine

    • Activation de cdc 42

      • Polymérisation de l’actine

      • Formation de faisceaux 

      • Filopodes et spicules

    • Activation de rac

      • Polymérisation de l’actine à la périphérie de la cellule 

      • Lamellipodes et ondulations

    • Activation de rho

      • Formation de faisceaux d’actine avec de la myosine II pour former des fibres de stress

      • Formation de contacts focaux par agglomération d’intégrines et protéines associées


    Mode d action de ces 3 interrupteurs

    Mode d’action de ces 3 « interrupteurs »

    • Nombreuses protéines cibles en aval

    •  modifications de l’organisation et de la dynamique de l’actine


    Etienne manneville s2002p6291

    Figure 1 The Rho GTPase cycle. Twenty mammalian Rho GTPases have been described: Rho (three isoforms: A, B, C); Rac (1, 2, 3); Cdc42; TC10; TCL; Chp (1, 2); RhoG; Rnd (1, 2, 3); RhoBTB (1, 2); RhoD; Rif; and TTF. They cycle between an active (GTP-bound) and an inactive (GDP-bound) conformation. In the active state, they interact with one of over 60 target proteins (effectors). The cycle is highly regulated by three classes of protein: in mammalian cells, around 60 guanine nucleotide exchange factors (GEFs) catalyse nucleotide exchange and mediate activation; more than 70 GTPase-activating proteins (GAPs) stimulate GTP hydrolysis, leading to inactivation; and four guanine nucleotide exchange inhibitors (GDIs) extract the inactive GTPase from membranes. All Rho GTPases are prenylated at their C terminus, and this is required for function. Rnd proteins are exceptional in that they do not hydrolyse GTP in vitro, which is an unusual property for a regulatory GTPase. It has been argued that they are controlled by expression, but it is equally possible that a yet to be identified GAP is required for hydrolysis.

    Les 3 membres de la famille Rho fonctionnent de façon semblable

    Activation par GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) (on en connaît plus de 20)

    Le cycle de la GTPase Rho

    Etienne-Manneville,S2002p629


    Fig16 50

    Fig16-50

    Effets de Rho, Rac, et Cdc42 sur l'organisation de l'actine dans le fibroblaste (actine colorée à la pholloïdine fluorescente, contacts focaux colorés par AC anti vinculine)

    Nombreuses fibres de stress et contacts focaux

    Énorme lamellipode qui fait le tour de la cellule

    Nombreux filopodes en périphérie

    actine colorée à la phalloïdine fluorescente, contacts focaux colorés par AC anti-vinculine


    Alan hall rho gtpases and the actin cytoskeleton science vol 279 issue 5350 23 january 1998 p 509

    Alan HallRho GTPases and the Actin CytoskeletonScience, Vol 279, Issue 5350, 23 january 1998, p 509

    • Fig. 1. Rho, Rac, and Cdc42 control the assembly and organization of the actin cytoskeleton. Quiescent, serum-starved Swiss 3T3 fibroblasts (-) contain very few organized actin filaments (A) or vinculincontaining integrin adhesion complexes (B). The effects of Rho, Rac, or Cdc42 activation in these cells can be observed in several different ways such as with the addition of extracellular growth factors, microinjection of activated GTPases, or microinjection of guanosine diphosphate (GDP)–guanosine triphosphate (GTP) exchange factors. Addition of the growth factor lysophosphatidic acid activates Rho, which leads to stress fiber (C) and focal adhesion formation (D). Microinjection of constitutively active Rac induces lamellipodia (E) and associated adhesion complexes (F). Microinjection of FGD1, an exchange factor for Cdc42, leads to formation of filopodia (G) and the associated adhesion complexes (H). Cdc42 activates Rac; hence, filopodia are intimately associated with lamellipodia, as shown in (G). In (A), (C), (E), and (G), actin filaments were visualized with rhodamine phalloidin; in (B), (D), (F ), and (H), the adhesion complexes were visualized with an antibody to vinculin. Scale: 1 cm 5 25 mm. [Figure courtesy of Kate Nobes]


    Alan hall science vol 279 issue 5350 23 january 1998 p509 rho gtpases and the actin cytoskeleton

    Alan Hall, Science, Vol 279, Issue 5350, 23 january 1998 p509Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton

    • Fig. 4. ERM proteins are required for GTPase-mediated cytoskeletal changes. It has been proposed that ERM proteins exist in a closed (inactive) conformation and an open (active) conformation. There is evidence to suggest that this transition can be regulated by Rho, perhaps through the activation of a Ser-Thr kinase or a lipid kinase (through PIP2). In the active conformation, the NH2-terminus of ERM proteins (pink) can interact with transmembrane proteins, such as CD44, whereas the COOH-terminus (blue) interacts with F-actin. This membrane–ERM–F-actin unit is an essential prerequisite for the Rho GTPases to induce cytoskeletal changes. In the case of Rho, this is likely to be mediated by the bundling and reorganization of preexisting actin-myosin filaments to generate stress fibers, whereas in the case of Rac and Cdc42 it is likely that preexisting filaments are uncapped to allow actin polymerization and filament growth leading to the formation of lamellipodia and filopodia.


    Alan hall science vol 279 issue 5350 23 january 1998 p509 rho gtpases and the actin cytoskeleton1

    Alan Hall, Science, Vol 279, Issue 5350, 23 january 1998 p509 Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton

    • Fig. 5. Cdc42p-associated signaling complexes in S. cerevisiae. Cdc42p is essential for both pheromone- induced mating and for nitrogen starvation–induced filamentous growth. In the pheromone response, Bem1p acts a scaffold protein and interacts with Cdc24p (an exchange factor for Cdc42p), Far1p (a cell cycle inhibitor), actin, Ste20p (a Ser-Thr kinase that can interact with Cdc42p), and Ste5p. Ste5p is a scaffold protein that interacts with components of a MAP kinase cascade. Ste20p activates the MAP kinase cascade, but no interaction with Cdc42p is required. A role of Cdc42p is to localize this signaling complex to the mating projection. Cdc42p and Ste20p are also required to activate a distinct MAP kinase pathway (still not completely defined) in response to nitrogen starvation. In this case, the interaction between Cdc42p and Ste20p is essential.


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