Marcadores Moleculares

1. Marcadores Moleculares

2. Marcadores Moleculares ADN ARN Proteínas Polipéptidos Enzimas Fenotipo

3. Marcadores Moleculares 1) Marcadores proteicos a) Proteínas de reserva b) Isoenzimas 2) Marcadores de ADN a) Basados en amplificación molecular  PCR b) Basados en hibridación molecular  RFLP c) Basados en amplificación + hibridación molecular  AFLP

4. Principales aplicaciones de los marcadores moleculares en fitomejoramiento 1) Identificación genética (genetic fingerprinting). a) Evaluación de la variabilidad genética preexistente. b) Clasificación por grupos heteróticos (predicción de la heterosis). c) Determinación de la "core collections" en los bancos de germoplasma d) Certificación de pureza de semillas. e) Identificación y protección legal de variedades. f) Caracterización e identificación de patógenos.

5. 2) Apoyo a los programas de mejoramiento. a) Selección asistida por marcadores moleculares. b) QTLs o "Quantitative Trait Loci" loci de rasgos cuantitativos. c) Backcross asistido (introgresión rápida de caracteres de interés). d) Backcross avanzado desde genotipos "no agronómicos" o especies silvestres 3) Otras aplicaciones. a) Construcción de mapas genéticos. b) Determinación de homología entre especies relacionadas por mapeo comparativo.

6. Contenido de ADN de algunos organismos y organelas • 1 pg= 0,965 x 109 pares de bases (pb) = 29 cm • Genoma haploide del hombre = 3,9 x 10 6 pb • Cada célula humana contiene 1,8 m de ADN

7. Extracción de ácidos nucleicos • Tipos de ácidos nucleicos a extraer: ADNss, ADNds,ARNs • Características del ADN: alto peso molecular y alta calidad. Pasos generales de un protocolo de extracción a partir de cualquier tejido y especie: 1) Lisis celular  Macerado con nitrógeno líquido 2) Extracción de ácidos nucleicos del macerado celular e inactivación de compuestos degradantes • Buffer de extracción (pH 8-9)  Disminuye la acción de ADNasas • Antioxidantes  Disminuye la formación de compuestos fenólicos p.e. BSA, -mercaptoetanol • Detergente + alta concentración salina acomplejamiento del ADN y desnaturalización de proteínas p.e. CTAB +ClNa

8. 3) Purificación y lavado  Combinaciones de extracción y precipitación • Lavado para remover carbohidratos y proteínas solventes orgánicos puros o en mezcla (p.e. fenol o cloroformo:alcohol isoamílico ) • Centrifugación separación del ADN en suspensión de los contamientes • Precipitación isopropanol o etanol • Puede realizarse un tratamiento con ARNasas o purificación en gradiente de ClCs para eliminar ARNs y obtener ADN de mayor pureza. 4) Secado y resuspención en el buffer de stock

9. Método CTAB

10. 5) Cuantificación del ADN extraído • Fluorómetro: el valor leído se intercala sobre una curva de calibración previa, y se extrapola la concentración de las muestras. • Espectrofotómetro de luz UV • Mediciones de absorbancia a longitudes de onda de A 230, A 260, A280, y A 310  A 260 / A 280 < 1,8  Contaminación con proteínas  A 260 / A 280 > 1,8 < 2  Buena calidad  A 260 / A 280 > 2  Contaminación con fenoles, cloroformo, etc, • Alta precisión, pero pueden verse afectadas por la presencia de contaminantes como proteínas, polisacáridos y ARNs. • Diluciones con un estándar de ADN comercial de concentración conocida, con bromuro de etidio. Se observan las diluciones a la luz UV en forma conjunta con los ADN incógnitas y se estima la concentración por comparación.

11. Geles de cuantificación (agarosa 0,8%) con marcadores de peso molecular conocido para cuantificar los ADN extraídos por comparación de bandas.

12. Marcadores moleculares de ADN basados en la hibridación RFLP

13. Enzimas de restricción • Endonucleasas • Capaces de cortar el ADN en sitios de secuencias de bases específicas  Sitios de restricción

14. Tipos de corte • En el centro de simetría de la secuencia de reconocimiento Produce fragmento de ADN con extremos “romos” o“rasurados • En diferentes posiciones del eje de simetría de la secuencia de reconocimiento Produce fragmento de ADN con extremos “cohesivos” o“pegajosos”

15. Origen y secuencias de reconocimiento de algunas endonucleasas de restricción Se conocen más de 400 enzimas de restricción

16. Acción de la enzima de restricción EcoRI:

17. Digestión de ADN con enzimas de restricción • Se generan fragmentos de diferente tamaño llamados segmentos de restricción • Un ADN pequeño como el de un cloroplasto puede generar 40 segmentos de restricción cuando se digiere con EcoRI • El tamaño de los fragmentos refleja la distribución de los sitios de restricción en el ADN • Estos fragmentos cargados negativamente migran hacia el ánodo en un campo eléctrico • Durante la electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida, migran en el gel a una tasa proporcional a sus pesos moleculares

18. Electroforesis de ADN • Los geles usados en la separación de ácidos nucleicos son matrices de agarosa o poliacrilamida, con tramas de dimensiones moleculares. • Los ácidos nucleicos están cargados negativamente, ellos emigran hacia el polo positivo en un campo eléctrico. • Cuando el campo eléctrico se aplica a través del gel, las cadenas más cortas se mueven más rápidamente que las más largas. Así, las cadenas se extienden en el gel según su tamaño.

19. El ADN doble cadena puede ser visualizado agregando bromuro de etidio, un químico aromático que se intercala entre los pares de bases de la hélice doble. Cuando el bromuro de etidio se halla ligado al ADN produce, al irradiarse con UV,una fluorescencia naranja. • La diferencia en los tamaños de los fragmentos obtenida por la digestión con enzimas de restricción del ADN nuclear, de una organela o el ADN total, se denomina “RFLP” Gel de agarosa coloreado con BrEt Calles 1y5: Marcador de peso molecular Calles 2,3,4: ADN de tres plantas de Solanum tuberosum digerido con EcoRI RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorphisms

20. Los RFLP del ADN nuclear no pueden ser directamente visualizados. • Para ello se usan pequeños fragmentos de ADN como sondas o “probes” para detectar fragmentos de restricción individuales Análisis por Southern blot del ADN de tres plantas de Solanum tuberosum. La sonda utilizada es un fragmento del gen nptII

21. Confección de bibliotecas de sondas o “library” • El ADN purificado de la especie de interés es digerido con enzimas de restricción • Los fragmentos de restricción individuales son unidos a plásmidos, y el plásmido es incorporado a una célula bacteriana (p.e. E.coli)

22. Se multiplican las células bacterianas transformadas. Los cultivos pueden mantenerse por largo tiempo • Aislamiento de los fragmentos de restricción de los plásmidos transformados. Se obtiene un gran número de copias para ser usados como sondas • Las sondas se marcan radioactivamente con P32 (2-5 Kb) • También puede usarse tinción no radiactiva basada en la quimioluniniscencia (p.e.dioxigenina)

23. Detección de RFLPs por la técnica de Southern Blot • Aislamiento y purificación del ADN • Digestión con enzimas de restricción (10-15 u/µg de ADN) Es conveniente hacer un minigel para verificar la digestión total del ADN previo a la corrida • Fracciónamiento y separación de los fragmentos de restricción mediante electroforesis en gel de agarosa (1%) La migración de los fragmentos debe ser lenta (de 6 hasta 48 horas)

24. Desnaturalización del ADN por inmersión del gel en solución desnaturalizante (OHNa + ClNa) Se forman cadenas simples de ADN que permiten la posterior hibridación de las sondas. • Southern Blot: el ADN monohebra es transferido del gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. • Desmontado el Southern se lava la membrana para eliminar restos de agarosa y se incuba envuelta en papel de filtro a 80°C para fijar el ADN a la membrana

25. Procesamiento de la sonda • La sonda, inserta en un plásmido, es separada mediante digestión con enzimas de restricción y electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión y purificada mediante columnas. • Cuantificación, ajuste de la concentración de la sonda y marcaje • Tratamiento de prehibridización • La membrana es tratada con solución de prehibridización para evitar hibridaciones inespecíficas de la sonda • La sonda desnaturalizada se agrega a la solución de prehibridización. La sonda hibrida con los fragmentos de restricción homólogos a ella. • Revelado por autoradiografía

26. Esquema de la técnica de Southern Blot

28. Herencia de los RPLPs • Para esta combinación particular de enzima de restricción y sonda de hibridación, se obtiene este modelo de hibridación de bandas • Siempre que los fragmentos reconocidos por la sonda sean de longitudes no-idénticas, decimos que las bandas son polimorficas.

29. Flor celeste Flor blanca 8 Kb 6 Kb rr Color de flor celeste dominante RR Padres homocigotas F1 Rr F2 8 Kb 6 Kb 8 Kb 6 Kb 8 Kb RR Rr Rr rr 6 Kb Los RFLPs son codominantes

31. Marcadores genéticos convencionales vs RFLP • Mayor variación de RFLP  se adaptan mejor a la construcción de mapas genéticos. • Los RFLPs no dependen del estado de desarrollo ni de las condiciones ambientales en las que crece determinado genotipo • Los RFLPs poseen bajo efecto fenotípico • Los RFPLs son codominantes y se comportan de esta manera en diferentes fondos genéticos