Földigiliszta reproduktivitási teszt OECD 222

1. Földigiliszta reproduktivitásitesztOECD 222 Csató Henrietta Enikő 2010.12. 06.

2. A teszt típusa • Laboratóriumi • Egy fajt alkalmazó + Könnyen elvégezhető laboratóriumban + Nem igényel drága műszereket - Kicsi a környezeti realizmusuk • Állati • Krónikus(reproduktivitási) • Hosszú idejű vizsgálat • Koncentráció–hatás görbe alapjángrafikusan vagy statisztikai módszerekkel meghatározott értékeket szokták megadni (NOEC, NOEL, NOAEC, NOAEL, LOEC, LOEL, MATC)

3. A tesztorganizmus (Eisenia fetida – trágyagiliszta) • Gyűrűsférgek törzsébe tartozik (nyeregképzők osztálya) • Testük gyűrűzött, hengeres, csupasz, nyálkás bőr fedi • Bőrük élettani funkciói: • Légzés • Fényérzékelés • Védekezés • Mozgás (összenőtt az izomzattal) • Bőrtömlőjéből alakítja ki szaporító szervét – váladékából a petéit tartó gubót képzi • A talajban lévő növényi anyagokat trágyává alakítják át, mellyel javítják a talaj minőségét. • A földigiliszták jelenléte a talaj egészségét jelzi. • Táplálkozásukkor a humuszos talaj egésze áthalad a bélcsatornájukon  innen az „ecosystemengineers” elnevezés

4. A tesztmódszer • A vegyi anyagok toxicitásának mérése a földigiliszták szaporodásgátlásán alapszik • A vizsgálat során felnőtt földigilisztákat tesznek ki a vizsgálandóanyag különböző koncentrációinak • melyet a talajba, vagy annak felszínére raknak • Az eljárás specifikusan alkalmazható a teszt céljától függően • A tesztben alkalmazott koncentrációsort aszerint kell beállítani, hogy az szubletális és letális hatást is okozzon egy nyolchetes periódus elmúltával. A halálozásra és növekedésre kifejtett hatásokat a felnőtt egyedek esetén négyhétnyi expozíciós idő után meghatározzák.

5. A tesztmódszer • A felnőtt gilisztákat ezután eltávolítják a talajról, hogy meghatározható legyen a szaporodás, melyet újabb négy hét eltelte után a talajban jelenlévő sarjadékok számával jellemeznek • A szennyezőanyagnak és a kontroll környezetnek kitett giliszták szaporodásának összehasonlításával meghatározhatóvá válik az a koncentráció, melynek nincs megfigyelhető hatása (NOEC) és amely adott mértékű gátlást okoz (vagyis ECx-ek) • Regressziós modellt használnak annak becslésére, hogy adott koncentráció mekkora százalékú szaporodás-csökkenést okoz.

6. A tesztmódszer • Az illékony vegyi anyagokon kívül alkalmazható az összes vegyianyag-fajta toxicitásának meghatározására • A teszt nem veszi figyelembe a vegyianyag csökkenését a teszt ideje alatt, emiatt a vegyianyag koncentrációjára nem kapunk valós kezdeti értékeket  Szükséges lehet egy analitikai meghatározás • A tesztnek ki kell elégíteni a validálási kritériumokat • ehhez referencia mérést kell végezni (1x 1 évben)

7. Szükséges felszerelés • 1–2 literes üveg vagy más vegyileg közömbös edény • Keresztmetszete hozzávetőlegesen 200 cm2 • Az edény teteje gáz- és fényáteresztő(a giliszták ne tudjanak abból megszökni!) • Normál laboratóriumi felszerelés • szárítószekrény, sztereomikroszkóp, pH- és fotométer pontos mérleg, vízfürdő, hőmérők, páratartalom mérésére alkalmas eszközök, inkubátor, csipeszek, tűk

8. A mesterséges talaj előkészítése • A tesztben alkalmazott mesterséges talaj összetevői: • 10% moha tőzeg • 20% kaolin agyag • 0,3–1,0% CaCO3, az optimális, 5,0–6,0 pH fenntartásához • 70%-osan száraz kvarc homok, túlnyomó részben finom homok (50–200 mikrométer) • A talaj száraz alkotóit homogenizáljuk • A talajt megnedvesítjük desztillált vízzel • úgy hogy az hozzávetőlegesen a fele legyen a végleges víztartalomnak, ami a 40–60%-a a maximális víztartó kapacitásnak

9. A tesztállatok kiválasztása és előkészítése • Eisenia fetidavagy Eisenia andrei fajok használhatóak • 10 db kerülegy edénybe • 2 hónapnál idősebb, de 1 évnél fiatalabb • Azonos korstruktúrával jellemezhető tenyészetből kell kiválasztani • Egy csoporton belül az egyedek korbeli különbsége max. 4 hét lehet • Le kell mérni a tömegüket • Előtte le kell őket mosni, és a felesleges vizet szűrőpapírral eltávolítani

10. A tesztelendő koncentrációk előkészítése A szennyezőanyag talajhoz adása kétféleképpen történhet: • Talajba keverés • Felületre adagolás Azt, hogy melyiket használjuk, a tesztelés célja dönti el, de általában a belekeveréses módszer a javasolt. Oldhatóságtól függően: • Ha az anyag oldódik vízben, akkor desztillált vízben kell oldani a teszt kezdetekor • Ha nem oldódik egy kis mennyiségű szerves oldószerben oldjuk fel, amit ezután hozzáadunk egy kis mennyiségű finom kvarc homokhoz. Az oldószert ezután elpárologtatjuk, majd a homokot az előnedvesített talajhoz adjuk.

11. A teszt összeállítása • A nedves táptalajt a teszt edényekbe rakjuk • A megmért gilisztákat a talaj felszínére helyezzükAz egészséges giliszták azonnal lyukat ásnak a táptalajba és eltűnnek a felszínről, azok a giliszták, amelyek a felszínen maradnak 15 perc elteltével is, nem tekinthetők alkalmasnak a teszthez, így azokat el kell távolítani a talajról. Az eltávolított giliszták helyére berakott új egyedeknek is le kell mérni a tömegét, hogy így a kezdésnél meghatározott legyen a kitett giliszták teljesélő tömege és az edény tömege a gilisztákkal együtt.  3.A tesztelendő anyag hozzáadásaNem adható a talajhoz a gilisztáktelepítésének félórájában(vagy amíg a giliszták a felszínen vannak), hogy nehogy közvetlenül érintkezzen a tesztanyag a giliszták bőrével. A tesztanyaghozzáadás előtt az edény tetejét le kell venni terelőt kell berakni, hogy a permetezés során beadott tesztanyag ne érje az edény falát. 4. A tesztedényeket fedő nélkül kell hagyni egy óráraAz illékony oldószerekelpárologtatásának céljából.

12. Tesztkörülmények • Hőmérséklet: 20 ± 2°C • A fényt speciálisan kell beállítani A teszt során félsötétben lejátszódó, a fény által kontrollált folyamatok mennek végbe, amihez 400–800 lux megvilágítást kell alkalmazni az edényeken belüli területen. • Az edények nem szellőzhetnek Azonban az edények tetejét úgy kell tervezni, hogy azokból a gáz távozhasson a teszt során. • A táptalaj víztartalmának fenntartása Ehhez az edények tömegét periodikusan meg kell mérni. A csökkenést, ha szükséges, desztillált vízzel pótoljuk. A víztartalom nem növekedhet meg a kezdeti érték 10%-ánál nagyobb mértékben.

13. A giliszták etetése • A giliszták testtömegének fenntartását szolgálja • Zabdara, tehén- vagy lótrágya Trágya esetén meg kell vizsgálni, hogy a ló ill. tehén nem állt-e gyógyszeres kezelés alatt, hogy a trágya toxicitása ne befolyásolja a mérést. A trágyának szárítottnak és pasztőrözöttnek kell lennie. • Előetetést kell végezni egy nem tesztpopulációval Mindezt azért, hogy a trágya minőségről megbizonyosodjanak. • Az első tápanyag-adagot a teszt indítása után egy nappal kapják meg • Hozzávetőlegesen 5 g eleséget adnak a talajhoz, amihez 5–6 ml desztillált vizet is adnak • Hetente 1x etetik meg a gilisztákat az első 4 hét alatt. • Ha nem ennék meg a beadott táplálékot, akkor csökkenteni kell az adagot • Az utolsó adag eleséget a 28. napon adják a talajhoz, a felnőtt giliszták eltávolítása után

14. A teszt értékelés • A 28. napon az élő gilisztákat megvizsgálják és megszámolják. Minden szokatlan viselkedést (pl. azt, hogy nem képesek a földbe ásni) és alaktani változást (pl. nyílt sebek) fel kell jegyezni. • Ezután az összes felnőtt gilisztát eltávolítják az edényből, megszámlálják és lemérik őket. A gilisztát tartalmazó talaj tálcára helyezése segít abban, hogy megtaláljuk a felnőtt gilisztákat. A gilisztákat mérés előtt megmossák és a felesleges vizet szűrőpapír csíkokkal távolítják el. • Az értékelésnél a meg nem talált gilisztákat elpusztultnak nyilvánítják feltételezve azt, hogy azok már szétbomlottak • A talajt további 4 hétre inkubálják, melynek végén megszámolják az ivadékokat, a kokonokat.

15. A végpontok • Letalitás Viselkedésbeli és alaktani változásokat a jelenlévő ivadékokkal együtt kell feljegyezni. Az LC50 értékeket probit analízissel vagy logisztikus regresszióval határozzák meg (akut toxicitás értékelési módja). 2.Termékenység (ivadékok száma). • Megkapjuk az ECx és NOEC adatokat A krónikus toxicitási tesztek statisztikai értékelésében legfontosabb annak a koncentrációnak a meghatározása, amelynek eredménye szignifikánsan eltér a kezeletlen kontrollétól. • Az értékeléshez az ANOVA statisztikai programot használjákAz ANOVA alkalmazásának célja általában a MATC (a szennyezőanyag maximális, még megengedhető koncentrációja) meghatározása. Az ANOVA variancia-analízis folyamata: • Az adatok transzformálása. • A kezeletlen kontroll és a vivőanyagot (pl. oldószert) tartalmazó kontroll összevetése, azonosságának ellenőrzése. • A kezelt csoportok variancia-analízise. • A kezelt csoportok összehasonlítása annak megállapítására, hogy melyik különbözik a kezeletlen kontrolltól.

16. Forrás • http://www.oecdbookshop.org/oecd/display.asp?K=5LMNG4B4F4S4&DS=Test-No.-222-Earthworm-Reproduction-Test-Eisenia-fetida/Eisenia-andrei • www.wikipedia.hu

17. Köszönöm a figyelmet!