狭基线纹香茶菜的保肝药效研究 及活性成分鉴定

1. 狭基线纹香茶菜的保肝药效研究 及活性成分鉴定 广州中医药大学中药学院 赖小平 二ＯＯ六 年 十一月

2. 前言 肝炎是严重危害我国人民健康的常见病之一。按病因主要分为病毒性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎以及多种病因交叉引起的慢性肝炎等。在各种肝炎疾病中，以乙型病毒性肝炎最为严重。 各类肝炎可展为慢性肝炎，20%可发展为肝硬化，1%~5%可转为肝癌。

3. 由于各类肝病的病因、病机十分复杂，迄今为止西医学对一些常见的肝病，如慢性肝纤维化、肝硬化等尚无理想特效药可以明显地减轻肝脏的损伤和坏死或促进肝细胞的再生与修复；而中医药却有着相当大的优势。二十余年来，中医药在肝脏疾病的防治发挥了重要的作用。由于各类肝病的病因、病机十分复杂，迄今为止西医学对一些常见的肝病，如慢性肝纤维化、肝硬化等尚无理想特效药可以明显地减轻肝脏的损伤和坏死或促进肝细胞的再生与修复；而中医药却有着相当大的优势。二十余年来，中医药在肝脏疾病的防治发挥了重要的作用。

4. 溪黄草－－狭基线纹香茶菜药效及成分研究

5. 狭基线纹香茶菜 Isodon lophanthoides var. gerardianus (Bentham) H.Hara是香茶菜属植物，为中药溪黄草的广东地区主流品种，具有清热利湿、退黄、凉血散瘀之功能。 近年来在活性成分及药效方面对该植物进行了大量的研究。主要采取不同动物模型筛选药物的活性物质，并综合研究药效和作用机制。

6. 实验方法 • 抗乙肝病毒实验（离体、在体） • 对免疫性肝损伤的保护作用 • 对急慢性酒精性肝损伤的保护作用 • 对急慢性化学性肝损伤的保护作用

7. 一、抗乙肝病毒实验 1. 体外抗乙肝病毒实验 MTT法测定药物对细胞生长的半数毒性浓度； 采用华美公司ELISA测定盒检测 HBsAg、HBeAg。 2. 体内抗鸭乙肝病毒实验 DHBV感染雏鸭13天后随机分组进行药物治疗试验。造模后取上述鸭血清， 每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA水平的变化，按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32P标记DHBV-DNA探针，并作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，在酶标检测仪上测定490nm 处OD值，计算血清DHBV-DNA密度。 CompanyLogo

8. 表1 药物对HBsAg和HBeAg的抑制效果及其细胞毒性 注： *与自身给药前（T0）对比P< 0.05, **与自身给药前（T0）对比P< 0.01， △与同期对照组比较P<0.05; △△与同期对照组比较P<0.01。 CompanyLogo

9. 药物在鸭体内对DHBV-DNA 的抑制作用 注： *与自身给药前（T0）对比P< 0.05, **与自身给药前（T0）对比P< 0.01， △与同期对照组比较P<0.05; △△与同期对照组比较P<0.01。 CompanyLogo

10. 实验结果显示狭基线纹香茶菜提取物能抑制鸭乙肝病毒DNA复制，抑制HepG2肝癌细胞株（表达和产生乙型肝炎标志物－－乙型肝炎抗原）。

11. 二、对免疫性肝损伤的保护作用 本研究采用脂多糖+卡介苗（ BCG+LPS ） 和刀豆蛋白（ Con A ）诱发的小鼠免疫性肝损伤动物模型研究狭基线纹香茶菜对免疫调节的影响。Con A是一种被广泛应用可活化T细胞的有丝分裂原，Con A诱发的小鼠肝损伤是近年来建立的实验动物模型，通过活化T淋巴细胞而致免疫性肝损伤是该动物模型的基本病理特点，该模型被认为更适于研究人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等的病理机制和进行抗免疫性肝损伤的药物筛选。

12. 模型1：卡介苗加脂多糖所致小鼠免疫性肝损伤模型1：卡介苗加脂多糖所致小鼠免疫性肝损伤

13. 模型2：刀豆蛋白所致小鼠免疫性肝损伤

15. 结果 • 1．狭基线纹香茶菜能抑制Con A 或BCG+LPS所致小鼠急性肝损伤后血清中的ALT、AST含量的升高；抑制损伤组肝组织中SOD活性的减少和MDA及NO含量的增加；对肝重量和脾重量增大有抑制作用。病理检查结果也同样显示出狭基线纹香茶菜对肝脏具有保护作用。 • 2．以上结果提示狭基线纹香茶菜有一定的降酶，抗过氧化，保护肝细胞，增强机体免疫作用。

16. 三、 对酒精性肝损伤的保护作用 • 急性酒精中毒模型： 连续给药8d，第8天各组小鼠禁食12h,均以14ml/kg体重56°红星二锅头酒灌胃，2h后,再次给药及饲以饲料，10h后采血，分离血清，按试剂盒说明测定血清ALT、AST活性及肝组织MDA含量。

17. 组别 剂量(g·kg-1) 肝脏系数 ALT(U·L-1) AST(U·L-1) MDA(nmol·m g -1) 空白组 — 4.234±0.211 25.3±8.4 75.2±23.3 19.8±5.101 模型组 — 4.957+0.224 68.4±22.9 150.5±25.4 45.836±6.270 联苯双酯 0.06 4.660+0.278* 31.4±10** 105.0±12.9* 29.236±4.738** 高剂 20 4.671+0.364* 40.0±12.1* 106.8±17.1 33.029±3.036** 中剂 10 4.574+0.373* 41.0±7.6* 133.6±11.2 36.859±12.518 低剂 5 4.793+0.450 37±9.7* 122.9±17.6 41.937±4.948## 药物对急性酒精中毒小鼠的肝脏系数、血清中 ALT/AST活性、组织MDA含量的影响（n=10） 注：与酒精对照组比较，** p＜0.01；* p＜0.05。与联苯双酯组比较，##p＜0.01； #p＜0.05。

18. 慢性酒精性脂肪肝模型： 正常组每天上、下午分别灌服10ml/kg饮用水；各给药组及模型组每天上午灌服不同浓度的药液或饮用水10ml/kg，下午灌服50°乙醇溶液10ml/kg。正常组饲以正常饲料，自由饮水；模型组、各给药组饲以自制20％的高脂饲料，自由饮水。造模3周后处死各组动物。取血分离血清测AST、ALT、TC、TG；测体重，取肝、脾、胸腺称重，计算各脏器系数。取部分肝组织做病理组织观察。

19. 组别 实验 例数 存活 例数 肝脏系数 胸腺系数 病理损伤 空白 10 10 3.13±0.28 0.14±0.021 正常 模型 12 8 3.96±0.56## 0.085±0.029## 脂肪病变，胞浆疏松化 （程度：＋＋＋＋） 联苯双酯 12 9 4.66±0.36##** 0.11±0.048#* 脂肪病变，胞浆疏松化 （程度：＋＋＋） 水飞蓟素 12 8 3.45±0.42# 0.093±0.032## 脂肪病变，胞浆疏松化 （程度：＋＋） ILVG 12 10 3.48±0.16# 0.103±0.017#* 脂肪病变，胞浆疏松化 （程度：＋＋） 药物对酒精性脂肪肝模型的作用（n=8） 注:与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01;与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

20. 结果： 与模型组比较，狭基线纹香茶菜提取物能降低急性酒精中毒小鼠的死亡率,并降低血清中ALT、AST含量、抑制肝脏肿大。 同时能降低慢性酒精性脂肪肝大鼠的死亡率，并减轻肝脏组织的病理损伤程度，但对血清转氨酶及血脂无明显降低作用。

21. D-半乳糖胺所致 急性肝损伤模型 四氯化碳所致 慢性肝纤维化模型 四氯化碳（SC） 对化学性肝损伤模型的保护作用

22. D－半乳糖胺致大鼠急性肝损伤实验方法： • 实验分组及给药 取SD大鼠60只，经适应性喂养后，随机分为正常对照组、模型组、狭基线纹香茶菜水提物高、中、低剂量给药组及联苯双酯阳性对照组共6个组。各给药组灌胃每天灌胃给药1次，共7天。于第6天下午，模型组和给药组一次性腹腔注射D-Gal致大鼠急性肝损伤。第8天，于末次给药24h后，从大鼠眼眶静脉丛取血，处死动物。 • 检测项目 检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）水平及总胆汁酸（TBA）、总胆红素（T-Bil）、总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）的含量，并计算A/G比值。同时测体重和肝脏重、脾重、胸腺重，求脏器系数，并切取肝脏制备匀浆，用蒽酮法进行检测肝糖原的含量。 • 病理观察 取肝脏，用10%中性甲醛固定，HE染色观察肝组织病理。

23. 对D-Gal所致急性肝损伤大鼠血清ALT、AST、ALP、TBA 和T-Bil的影响

24. 对血清TP、ALB、A/G及肝糖的影响 （D—半乳糖胺肝损伤模型）

25. 实验分组及给药 取SD大鼠60只，经适应性喂养后，随机分为正常对照组、模型组、狭基线纹香茶菜水提物高、中、低剂量给药组及联苯双酯阳性对照组共6个组。各给药组灌胃每天灌胃给药1次，共10d。模型组和给药组每隔3d腹腔注射10% CCl4致大鼠肝损伤。第11天，末次给药24h后，从大鼠眼眶静脉丛取血，处死动物。 检测项目 检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）水平及总胆汁酸（TBA）、总胆红素（T-Bil）含量。同时测体重和肝脏重、脾重、胸腺重，求脏器系数。 病理观察 取肝脏，用10%中性甲醛固定，HE染色观察肝组织病理。 四氯化碳所致大鼠急性肝损伤实验方法：

26. 狭基线纹香茶菜对CCl4所致急性肝损伤大鼠血清狭基线纹香茶菜对CCl4所致急性肝损伤大鼠血清 ALT、AST、ALP、TBA 和T-Bil的影响

28. 结果分析： • 提示：狭基线纹香茶菜能抑制CCl4、D-Gal所致大鼠急性肝损伤后血清中的ALT、AST和ALP活性的升高及T-Bil和TBA含量的增加 ，具有降酶作用。 • 促进肝损伤大鼠血清中TP、肝组织中肝糖原的增加，显示具有改善肝功能的作用。

29. 对CCl4所致大鼠慢性肝纤维化的保护作用 方法：取Wistar大鼠，随机分为正常组、模型组、狭基线纹香茶菜给药组。模型组及狭基线纹香茶菜给药组动物饲每隔3d皮下注射30％CCl4花生油溶液3ml/kg。各组动物均给予全颗饲料并自由饮水；狭基线纹香茶菜给药组给药剂量为10g /kg·d。造模8w后，处死各组动物，取血分离血清，检测AST，并取肝组织作病理切片检查。 结果：

30. 对大鼠胆汁排泄的影响及 胆汁 瘀积模型的保护作用

31. 结果提示：在利胆实验中，狭基线纹香茶菜提取物能促进正常大鼠的胆汁排泄及延长胆汁瘀积模型大鼠的寿命。

32. 具有保肝活性的有效部位中分离鉴定以下几个化合物具有保肝活性的有效部位中分离鉴定以下几个化合物 X-2 熊果酸 (ursolic acid) R1 = R2 = H X-3 2α-羟基熊果酸 (2α-hydroxy ursolic acid) R1 = OH, R2 = H X-4 2α,19-二羟基熊果酸 (2α,19α-dihydroxy ursolic acid) R1 = R2 = OH

33. X-5 迷迭香酸(rosmarinic acid) R = H

34. 有效成分的体外抗乙肝病毒试验 经过对HepG2肝癌细胞株（即2.2.15细胞）分泌乙肝标志物影响试验，2α-羟基熊果酸和2α,19-二羟基熊果酸分别在125和250μg/ml浓度下对乙肝表面抗原HBsAg的分泌有明显抑制作用，抑制率分别为74.34%-85.84%和88.71%-97.58%，治疗指数分别为0.57和1.08；但对乙肝e抗原HBeAg的分泌没有明显影响，这与阳性对照品病毒唑在2.2.15细胞模型上的作用特点相似。

35. 迷迭香酸则有很强的抗氧化作用。其对由维生素C-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或由Fe2+-半胱氨酸诱发的大鼠脑、肝、肾微粒体的脂质过氧化都有强抑制作用，该作用是维生素E的102-103倍；并且有促纤维蛋白溶解活性；对单纯疱疹病毒也有一定的抑制作用[孙文基、绳金房主编. 天然活性成分简明手册，488页，中国医药科技出版社，北京，1998年]。

36. 狭基线纹香茶菜活性成分的提取工艺及应用已申请专利。狭基线纹香茶菜活性成分的提取工艺及应用已申请专利。 专利受理号－－200610122259.9

37. 讨论： 药效研究从抗乙肝病毒、免疫性肝损伤、酒精性肝损伤、化学性肝损伤、胆汁瘀积等研究狭基线纹香茶菜的保肝利胆作用，结果显示狭基线纹香茶菜能明显改善实验性肝损伤小、大鼠肝脏的结构和功能，其护肝的机理可能与保护细胞膜，促进肝细胞恢复和再生、胆汁排泄，清除自由基，抗脂质过氧化以及免疫功能调节等多个环节有关，从而达到降酶，清除黄疸，调节肝脏代谢和免疫功能，减少病理损伤的效果。

38. 从临床治疗肝病的疗效、基础研究动物模型实验结果可以看出，狭基线纹香茶菜在治疗肝脏疾病方面具有改善肝功能、增强机体免疫力、促进受损肝组织修复等作用，并且不出现致肝炎病毒变异而加重疾病的现象。从临床治疗肝病的疗效、基础研究动物模型实验结果可以看出，狭基线纹香茶菜在治疗肝脏疾病方面具有改善肝功能、增强机体免疫力、促进受损肝组织修复等作用，并且不出现致肝炎病毒变异而加重疾病的现象。

39. 秉承中医药治病的原则与方法，将临床验方、有效方，通过制剂学研究及药效毒理学研究，开发成使用方便、高效、安全的中药产品，将具有广泛的社会效益。秉承中医药治病的原则与方法，将临床验方、有效方，通过制剂学研究及药效毒理学研究，开发成使用方便、高效、安全的中药产品，将具有广泛的社会效益。

40. 谢 谢 THANKS