实验题目
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不连续系统 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳 PowerPoint PPT Presentation


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实验题目. 不连续系统 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳. 实验目的. 掌握电泳分离纯化蛋白质的 方法 与 原理. 聚丙烯酰胺凝胶系统简介. 聚丙烯酰胺凝胶. 缓冲系统. 聚丙烯酰胺凝胶简介. 凝胶 组成成份:. 丙烯酰胺单体. 甲叉双丙烯酰胺. 催化剂(过硫酸铵). 加速剂 ( 四甲基已二胺 TEMED ) 。. 聚合交联起来,形成三维网状结构的凝胶。. 凝胶浓度的选择. 分离蛋白质或核等大分子混合的关键 : 选择一定孔径的凝胶 凝胶的孔径 : 丙烯酸和甲叉双丙烯酰胺总浓度( T %)的控制 , T %越大,孔径越小

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不连续系统 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳

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Presentation Transcript


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实验题目

不连续系统

聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳


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实验目的

  • 掌握电泳分离纯化蛋白质的 方法 与 原理


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聚丙烯酰胺凝胶系统简介

聚丙烯酰胺凝胶

缓冲系统


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聚丙烯酰胺凝胶简介

凝胶组成成份:

丙烯酰胺单体

甲叉双丙烯酰胺

催化剂(过硫酸铵)

加速剂 (四甲基已二胺 TEMED) 。

聚合交联起来,形成三维网状结构的凝胶。


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凝胶浓度的选择

  • 分离蛋白质或核等大分子混合的关键: 选择一定孔径的凝胶

  • 凝胶的孔径:丙烯酸和甲叉双丙烯酰胺总浓度(T%)的控制, T%越大,孔径越小

  • 根据所要分离的蛋白质的分子量大小选择适当的凝胶浓度

  • 常用的标准凝胶是指浓度为7.5%,大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能得到满意的结果


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缓冲系统的选择

  • 适当的缓冲浓系统: 是电泳的关键问题,特别要注意PH范围及离子。

  • 电泳所选择的PH应能使蛋白质分子处于较大电荷状态,

  • 因此PH要远离蛋白质的等电点,使蛋白质分子中羧基或氨基的解离度尽量增大

  • 但要避免由于缓冲度PH过高或过低而损害样品的稳定性,离子强度通常选用0.01~0.1M


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不连续性表现

凝胶的选泽:

1.分离胶

2.浓缩胶

缓冲液的选择;

1.样品及浓缩胶中缓冲液:

pH6.7 Tris—HCl缓冲液。

2.电极槽缓冲液 :

pH8.3 Tris一甘氨酸缓冲


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上槽电极缓冲液, pH8.3 Tris一甘氨酸

样品,

pH6.7 Tris—HCI

浓缩胶

分离胶 pH8.3 Tris一甘氨酸

实验原理


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(一)浓缩效应:

浓缩胶系统中含有大小不同的离子为:

Cl—、

Pr—(蛋白质离子)、

H2N—CH2COO—(甘氨酸离子)。

pH6.7缓冲液中

HCl几乎全部解离为Cl-,

甘氨酸等电点接近6.7,有少量甘氨酸分子解离,

而血清蛋白质的等电点一般为pH5左右,其解离度在HCl和甘氨酸之间 。

电泳系统通电后:这三种离子泳动效率是

Cl->Pr-> H2NCH2COO—


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(二)电荷效应

  • 蛋白质混合物在界面处被高度浓缩,

    堆积成层,形成一狭小的高浓度蛋白区

  • 但由于每种蛋白质分子所载有电荷不面,

    泳动率不同。

  • 通过此种电荷故应,各种蛋白质以一定的顺序排列成一个一个的园盘状。


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(三)分子筛效应

  • 蛋白质分子在电场作用下泳动时,受到两种力的影响,即静电引力和介质阻力的作用。

  • 分子大小或构象不同的蛋白质,通过一定孔径的分离胶时,所受摩擦力不同,受阻滞的程度不同,此也表现出不同的迁移率。

  • 即使蛋白质所带的净电荷相似;也由干分子筛效应而在分离胶中被分离开来。


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实验操作

2.样品配制:

1.凝胶柱的制备

3、电泳:

4.染色与脱色


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7.5cm处画线(浓缩胶)

7cm处画线(分离胶)

1.凝胶柱的制备

如图画线


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分离胶溶液的配制

  • 按上表配制分离胶,用胶头滴管沿管壁缓慢

  • 加入到 7cm划线处。如有气泡设法排除

(2) 随即用胶头滴管沿凝胶管壁缓慢加入蒸馏水

约3-4滴,注意防止胶液表面的震动与扩散。

  • 静止约20-30分钟,在凝胶表面与水之间出

  • 现渐清的界面,表示聚合已完成,用滤纸条轻

  • 轻吸会凝胶表面水份,注意不能损伤已聚合的

  • 凝胶表面。


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浓缩胶溶液的配制

(1)按上表配制浓缩胶,立即用胶头滴管将其

加至玻璃管中分离胶上至7.5cm划线平面,

(2)随即用胶头滴管沿凝胶管壁缓慢加 入蒸

馏水3-4滴,注意防止胶液表面 的震动

与扩散。

(3)放置约20-30分钟左右,

用滤纸轻轻吸除水份待用。


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2.样品配制:

正常人血清0.3ml,加入样品稀释液1.7ml,内含溴酚兰0.005%为示踪染料。


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3.电泳:

①安装凝胶柱:将制备好的凝胶管插入

上电泳槽的 橡胶塞孔中

②加缓冲液: 下电泳槽中加入电极缓冲

液,放上上电泳槽,再装满电极缓冲液

③上样:加样器吸取样品,加入1大滴,

或2小滴,沿管壁加在浓缩胶面上。


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④ 接通电流:

电流为 l mA/管,10分钟后,

调节电流为4mA/管。

待示踪染料迁移到管下端时,切断电源

(电泳时间约2.5小时)。

⑤剥离凝胶:

取下凝胶管,

用注射器盛蒸馏水,沿管壁插入管内,

边插入边注水,

然后用吸耳球轻轻在胶管的一端加压,

使凝胶柱从管中慢慢滑出,装入到细试管中。


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4.染色与脱色

①将凝胶柱置于小试管中,加入染色液,

60℃中染色18-20分钟。

②倒出染色液,换以脱色液,

60℃中脱色30~60分钟。


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实验结果

  • 根据染色后观察的条带。在报告上画图。

实验讨论

  • 分离纯化蛋白质的方法有哪些?

    各自的原理


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注意事项

  • 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经性毒剂,对皮肤有刺激作用,应避免直接接触。

  • 电泳完毕后,上下槽电泳缓冲液不能混,因离子强度PH都已发生改变。


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