Anticorpi monoclonali
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ANTICORPI MONOCLONALI - PowerPoint PPT Presentation


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ANTICORPI MONOCLONALI. Adapted from M ilstein (1980) Scientific American , Oct. p.58. 1. 1. 2. 2. 3. 3. 4. 4. 1. m. 3. m. 2. m. 4. m. Antigen. Spleen cells. Immunization. + Myeloma. B cell. 1. 3. Cell fusion. 2. 1. 2. 3. 4. 4. x. 1. 2. 3. 4. Monoclonal

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Presentation Transcript

Adapted from Milstein (1980) Scientific American, Oct. p.58

1

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1

m

3

m

2

m

4

m

Antigen

Spleen cells

Immunization

+

Myeloma

B cell

1

3

Cell fusion

2

1

2

3

4

4

x

1

2

3

4

Monoclonal

antibodies

Antiseum

Pure single Ab

A mixture of all Ab

If a single B cell was picked up and cultured, then it will produce only one kind of antibody.

But B cell can not survive well in the culture.

Each B cell produces only one kind of antibody, which binds to its specific antigen.

Conventional antiserum is the mixture of all antibodies produced by B cells from spleen.

If B cell is fused with myeloma, the fused cell might be cultured and produce antibody.

Each hybridoma line can produce pure single antibody, called monoclonal antibody.

Myeloma cell can be cultured in the test tube, but can not produce useful antibody.

After immunization, the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies.


Antibodies
Antibodies

Polyclonal

Monoclonal

Individual B lymphocyte hybridoma

is cloned and cultured.

Secreted antibodies are collected

from culture media

Antibodies that are collected

from sera of exposed animal

recognize

multiple antigenic sites

of injected biochemical.

recognize

ONE antigenic site

of injected biochemical


Hybridoma
Hybridoma

1975 Kohler and Milstein

Multiple myeloma (human disease)

Fusions generated

by Sendai virus

or PEG

Bence Jones proteins in urine

http://www.immunecentral.com/images/immune_series/immune29.gif


Creation of monoclonal antibodies mab s
Creation of monoclonal antibodies (mAb’s)

1. Hyperimmunize mouse with Ag

2. Fuse B cells with tumor fusion partner (+ PEG)

3. Limiting dilution (96 wells)

to fractionate fused cells

in HAT media selection

HAT media (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).

B cells die (mortal, HGPRT-positive)

Tumor cells die (HGPRT deficient and cannot utilise salvage pathway)

Fusions live (HAT Resistant and immortal)


Hybridoma selection hat media
Hybridoma selection (HAT media)

The de novo pathway can be inhibited using aminopterin,

which inhibits the transfer of methyl groups

from activated dihydrofolic acid.

cells needHypoxanthine and Thymine as sources of purines and pyrimidines for the salvage pathway.

Myeloma cells are HGPRT- and cannot create nucleotides in the salvage pathway.

Plasma cells are HGPRT+ and can utilize hypoxanthine in the salvage pathway.


Expand in mice or expand in vitro
Expand in mice or expand in vitro

in vitro material is less concentrated

and contains

bovine serum

ascites fluid

contain high [mAb]

and minor contamination

with mouse Ig


How to purify your mab
How to purify your MAb

Affinity Purification

Or use Ag or epitope

to make

affinity column

Monospecific

antibodies

http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/pwpt/17_mab.pdf


Impieghi degli anticorpi monoclonali
IMPIEGHI DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI

  • Protein purification

  • Identification and isolation of cell sub-populations using fluorescence cell sorting.

  • Tumor detection and imaging

  • Tumor killing

  • Diagnostic reagents.

  • Drug Detoxification

  • Catalytic antibodies



Immunoprecipitation

At appropriate ratio of antigen:antibody, complex forms an insoluble aggregate.

Technique can be used to purify specific protein from a mixture

Co-immunoprecipitation – interacting proteins also found in the immunoprecipitate

Immunoprecipitation


Impieghi dell’immunoprecipitazione insoluble aggregate.

  • Determinazione delle concentrazioni relative di anticorpi o di antigeni

  • Confrontare diversi antigeni tra loro

  • Stabilire la purezza di un preparato antigenico


Immunodiffusione1
Immunodiffusione insoluble aggregate.

  • Quando l'immunoprecipitazione avviene all'interno di un gel si parla più propriamente di immunodiffusione.

  • Immunodiffusione radiale

  • Immunodiffusione doppia

  • immunoelettroforesi


Diagrammi di possibili insoluble aggregate.

Modelli di precipitazione

con la doppia immuno-

diffusione eseguita su un

antisiero e 2 diversi

preparati antigenici

A: epitopi identici

B:nessun epitopo in

comune

C:identità parziale


IMMUNOELETTROFORESI insoluble aggregate.

Separazione elettroforetica degli Ag

Archi di precipitazione



Immunoelettroforesi quantitativa Ab isotipi, come si verifica in alcune immunodeficienze

Ponendo in grafico l’altezza degli archi contro la concentrazione

Si otterrà una retta di taratura che può servire per determinare

la concentrazione di Ag in un campione incognito


TEST DI GRAVIDANZA: ES. DI INIBIZIONE DI AGGLUTINAZIONE Ab isotipi, come si verifica in alcune immunodeficienze

(Presenza o assenza di gonadotropina)


Immunofluorescenza
IMMUNOFLUORESCENZA Ab isotipi, come si verifica in alcune immunodeficienze


Gli Ab sono marcati con molecole fluorescenti Ab isotipi, come si verifica in alcune immunodeficienze


  • Le molecole fluorescenti assorbono luce a una determinata lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).

  • Se gli Ab sono marcati con i fluorocromi, possono essere rilevati attraverso la valutazione della luce colorata emessa in seguito all’eccitazione a una determinata lunghezza d’onda

  • La luce emessa può essere rivelata con un microscopio a fluorescenza

  • I coloranti possono essere coniugati alla regione Fc di una molecola senza modificarne la specificità

  • Coloranti: fluoresceina, rodamina, ficoeritrina


Immunofluorescense
Immunofluorescense lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).

IFA of Ehrlichia chaffeensis

in DH82 cells, 400X

Bullous pemphgoid with linear deposits

of IgG at dermal-epidermal junction

Very good rapid diagnostics


Citofluorimetria e fluorescenza
Citofluorimetria e fluorescenza lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).

  • Queste tecniche si basano sull’impiego di Ab fluorescenti a hanno carattere qualitativo

  • FACS (fluorescence-activated cell sorter)

  • Quando una cellula passa davanti al raggio laser, la luce viene deviata dal rilevatore e questa interruzione del segnale laser viene registrata. Le cellule che possiedono l’Ab fluorescente legato ai loro Ag di membrana vengono eccitate dal laser ed emettono luce, che viene registrato da un secondo sistema, localizzato ad angolo retto rispetto al raggio laser.

  • Lo strumento conta ogni cellule quando passa davanti al raggio laser e registra i livelli di fluorescenza emessa dalla cellula

  • Un computer collegato crea i diagrammi con il numero delle cellule in ordinata e la loro intensità di fluorescenza in ascissa


SEPARAZIONE DI CELLULE MARCATE CON Ab lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).


Diagnostica
DIAGNOSTICA lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).


Elisa enzyme linked immunosorbent assay
ELISA – lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Test antiserum

Test antigen


Visualization of reaction
Visualization of reaction lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).


Elisa to test mab production itself
ELISA to test MAb production itself lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).

The dark blue spot represents a positive clone.

The light blue spots are positive controls,

the next two wells to the right are negative controls

www.ch.tum.de/wasser/weller/ formerprojects_im...


SAGGIO lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).

ELISPOT


Saggio radio immunologico
Saggio radio-immunologico lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).

  • Il metodo è basato sulla competizione tra un antigene non marcato e una quantità fissa dello stesso antigene marcato, per il legame con un numero limitante e costante di siti anticorpali.

    • Ab + Ag* Ab/Ag*

    • Ab/Ag* + Ag Ab/Ag Ab/Ag*

  • E' necessario costruire prima di tutto una curva di taratura,

  • % conc. Ag

    Marcato legato a Ab

    Tratto lineare

    Conc. Ag non marcato


    Frazioni di ab
    FRAZIONI DI Ab lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).


    The fab fragment contains the antigen binding site
    The Fab fragment contains the antigen binding site lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).

    Could be cleaved out by papain digest;

    pepsin digestion even better, as it produces F(ab’)2

    Often it is enough

    for diagnostic purposes –

    and it is easier to produce

    Anti Botulinum toxin

    Equine FAB fragment product

    made by DoD at time of Gulf War,

    anti-ABCDEFG

    Hinge

    region

    www-structure.llnl.gov/ fab/fab_tutl.htm


    Single chain fv fragments
    Single chain Fv fragments lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).

    The size and specificity

    of the ScFv fragment

    may allow for attachment

    to cryptic sites

    http://www.gene-therapeutics.com/Service/custom%20scFv%20antibodies/Abb-scFv.gif


    Impieghi come farmaci
    IMPIEGHI COME FARMACI lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).


    About 25 30 of women who have metastatic breast cancer overexpress her 2 egf receptor
    About 25-30% of women who have lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).metastatic breast cancer overexpress HER-2 (EGF) receptor

    Determination of HER2-protein overexpression

    (semiquantitative DAKO Hercep Test™)

    Fluorescence in situ hybridisation (FISH)

    of HER2 amplification

    www.roche.com/pages/ facets/9/herc.htm


    Herceptin trastuzumab anti her mabs
    Herceptin (TrastuzuMAb) lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).anti-HER MAbs

    Approved!

    http://www.roche.com/pages/facets/9/herc1.jpg


    Problemi con la terapia basata su mab
    Problemi con la terapia basata su mAb lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).

    • Gli Ab di topo sono visti come estranei dal sistema immunitario umano

    • Innesco della risposta immunitaria contro gli HAMA (human anti-mouse antibody)

    • Danni nell’ospite

    • mAb causerebbero meno problemi

    • (volontari cercasi??!!)

    • Soluzione: anticorpi ibridi uomo-topo


    • Anticorpi chimerici lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).: Combinazione della regione variabile di topo con la regione costante di uomo

    • Anticorpi umanizzati: Ab combina solo gli aa della regione ipervariabile di topo con il resto di Ab umano


    Anticorpi umanizzati lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).

    Clone those genes

    and express them

    as a recombinant protein

    in the protein expression system

    Sales of Rituxan/

    MabThera by Year

    http://www.sh.lsuhsc.edu/

    intragrad/micro/micro297/4


    Topi transgenici con segmenti genici di anticorpi umani lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).


    Xenomouse topo con igh e igk umani
    Xenomouse lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).(topo con IgH e Igk umani)

    Abgenix

    http://www.sh.lsuhsc.edu/

    intragrad/micro/micro297/4


    Immunotoxin antibody toxin conjugate

    waynesword.palomar.edu/ images/antibod2.gif lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).

    Immunotoxin: Antibody-Toxin Conjugate

    Antibody

    is tumor-specific

    ricin from the castor bean

    (Ricinus communis).


    Only the targeted tumor cells are killed by the toxin
    Only the targeted tumor cells are killed by the toxin lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).

    Common side effect –

    Vascular leak syndrome.

    Could be relieved

    by usage of mutated toxin

    Bunch of other toxins

    could be used


    Saponin from soapwort

    : lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione).www.som.soton.ac.uk/.../members/ DFlavell/djf2.htm

    potent

    single chain ribosome inactivating protein

    Saponin (from soapwort)

    Goal:

    treatment of

    leukemias

    and lymphomas

    For T-cell leukemia could be

    targeted via CD7


    Monoclonal antibodies, lunghezza d’onda (eccitazione)e la emettono ad un’altra lunghezza d’onda (emissione). which are specific for a certain antigen, i.e. prostate carcinoma cells, can be tagged with a radioactive tracer,which when injected into the body will localize in areas of these recurrent carcinoma cells

    www.stjosephs-marshfield.org/

    OctreoScan in a patient

    with metastatic small cell carcinoma of the prostate


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