新生儿干血斑
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新生儿干血斑 G6PD 筛查检测及其室间质量保证 PowerPoint PPT Presentation


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新生儿干血斑 G6PD 筛查检测及其室间质量保证. 江剑辉 广州市新生儿筛查中心. 一、干血斑荧光斑点测定法. 1.原理. 正常人: 葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶( G6PD) 的催化下生成6-磷酸葡萄糖酸(6 PG), 并产生还原型辅酶Ⅱ( NADPH), 此产物在特定波长紫外线光照射下可发荧光。 G6PD 缺陷: 因 NADPH 生成减少,则荧光减弱或不产生荧光。

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新生儿干血斑 G6PD 筛查检测及其室间质量保证

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Presentation Transcript


G6pd

新生儿干血斑G6PD筛查检测及其室间质量保证

江剑辉

广州市新生儿筛查中心


G6pd

一、干血斑荧光斑点测定法


G6pd

1.原理

  • 正常人:葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的催化下生成6-磷酸葡萄糖酸(6PG),并产生还原型辅酶Ⅱ(NADPH),此产物在特定波长紫外线光照射下可发荧光。

  • G6PD缺陷:因NADPH生成减少,则荧光减弱或不产生荧光。

  • 氧化型谷胱甘肽(GSSG )的应用:NADPH又参与红细胞氧化型谷胱甘肽(GSSG)转变为还原型谷胱甘肽(GSH)的反应,在反应液中加入GSSG,使NADPH被消耗并氧化成无荧光的氧化型辅酶Ⅱ(NADP),使杂合子容易检出。


G6pd

GSH GSSG

NADP NADPH(荧光)

G6PD­

葡萄糖 →葡萄糖-6-磷酸 6-磷酸葡萄糖酸

(G6P) (6PG)

磷酸戊糖

红细胞G6PD代谢示意图

NADP 氧化型辅酶Ⅱ GSSG 氧化型谷胱甘肽

NADPH 还原型辅酶Ⅱ GSH 还原型谷胱甘肽


G6pd

2.仪器和材料

  • 1)仪器

  • ①ZF-1型(激发光波长254nm和 365nm)紫外线分析仪(上海顾村电光仪器厂)。

  • ②水浴箱或电热烘箱。

  • ③新华定性滤纸。

  • ④3mm打孔器(钳)。

  • 2)标本:血纸片在室温下自然晾干,避免日照,尽快检测(或置4℃冰箱内1周内检测)。

  • 4)试剂


G6pd

3.实验操作步骤

  • 用打孔器取直径3mm的血斑纸片于试管或酶标板中

  • 加入反应混合液100ul

  • 孵化:置37℃温箱中或电热烘箱30分钟,

  • 用吸管取少量浸出液于滤纸上,立即用风筒(低挡凉风)吹干

  • 将滤纸置紫外灯下观察荧光反应。


G6pd

4.结果判断

  • (1)正常:孵化10分钟后出现荧光。

  • (2)轻度缺陷:孵化20分钟有荧光。

  • (3)中度缺陷:孵化30分钟有荧光。

  • (4)重度缺陷:孵化30分钟仍无荧光。

  • 荧光斑点试验的特异性高,对男性半合子和女性纯合子的检出率高达100%。对G6PD活性正常者与直接测定法(分光光度法)符合率为98.8%。


G6pd

方法学特点

  • 荧光斑点试验的特异性高,对男性半合子和女性纯合子的检出率高达100%。

  • 对G6PD活性正常者与直接测定法(分光光度法)符合率为98.8%。


G6pd

5.注意事项

  • (1) 孵化前检查试管内纸片是否在反应液内。

  • (2) 滴浸出液前摇动试管,以混匀浸出液。

  • (3)每次滴后迅速吹干滤纸后才观察荧光,因斑点湿润时荧光会减弱。


G6pd

二、用荧光定量法测定干血斑G6PD活性


G6pd

1.原理:

  • 正常机体G6PD催化二磷酸己糖旁路反应的第一步为:G6P底物在G6PD催化下转变成6PG,同时伴随发生NADP减少,NADPH(可发荧光)增加。

  • 筛查血斑标本与底物试剂G6P和NADP在室温下混合30分钟可发生上述反应

  • 加入铜溶液使反应终止,用荧光仪在波长355nm激发光和波长460nm发射光下测定反应物荧光。

  • 通过标准曲线得出未知样本和质控品中G6PD浓度(U/gHb), G6PD低于切值者为G6PD缺乏。


G6pd

2.材料与方法

  • (1) 标本来源: 新生儿筛查滤纸干血斑标本,采血滤纸为筛查专用S&S903滤纸。

  • (2) 试剂及仪器:

  • 试剂盒

  • 荧光读数测定仪。


G6pd

(3)操作步骤

  • 打孔

  • 加G6PD酶反应混合液(100ul/孔)

  • 恒温25℃、振速1150 r/min 振荡30分钟,

  • 去纸片

  • 加200ul/孔铜试剂

  • 激发波355nm和发射波460nm荧光读数 。


G6pd

3.结果判断

(1)参考切值:G6PD = 2.0 IU/gHb

(2) G6PD ≥2.0 IU/gHb 判断为G6PD正常

G6PD <2.0 IU/gHb 判断为G6PD缺乏阳 性

(3)每个实验室应根据本筛查网络的标本条件和本地G6PD缺乏发病率设定切值.


G6pd

比色定量法(四唑氮蓝法)简介

  • 打纸片

  • 加200L 缓冲液,在室温(18-37oC)下摇晃孵育20分钟。

  • 孵育20分钟

  • 加100ul的稀释液

  • 在550 或570 nm 下读取读数(初始读数)。

  • 在室温(18-37oC)下孵育孔板10分钟,此步不要摇晃。

  • 在550 或570 nm 下读取读数(终末读数)


G6pd

4.注意事项

  • (1)G6PD反应混合液配制后要待充分反应15分钟才能使用

  • (2)已配制的G6PD反应混合液保质期限为7天,应在保质期限内使用否则会对实验造成影响

  • (3)荧光测定时间延长可能会影响测定荧光值,建议在加入终止液后15~30分钟内完成荧光检测

    (4)纸片降低测定的荧光值


G6pd

参加G6PD检测室间质量保证计划

  • 台北阳明大学提供

  • 质控品:10份/次,6~10次/年

  • 质控品送出后一周内完成结果上报

  • 质控结果


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