Genética Molecular em Análises Clinicas

1. Genética Molecular em Análises Clinicas TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Prof.Doutor José Cabeda

2. Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos • PCR • Real Time PCR • NASBA/TMA

3. PCR

5. OPTIMIZAÇÃO DO PCR • [MgCl2] • Th • [dNTP] • [primers] • [DNA] • [inibidores]

6. Variações • RT-PCR • Multiplex PCR • Nested PCR

7. Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos • PCR • Real Time PCR • NASBA/TMA

8. Principio de funcionamento do Real-Time PCR Prof.Doutor José Cabeda

10. Detecção dos produtos de PCR

11. Montar uma reacção

12. Químicas Utilizáveis Prof.Doutor José Cabeda

13. 3’ 5’ SG SG SG SG SG Excitation 3’ 5’ SYBR-Green I

14. 3’ 5’ SG SG SG SG SG Excitation Emission 3’ 5’ SYBR-Green I

15. Detcção com SybGreen

16. Sybr-Green Detection • Intercalates to dsDNA • Inhibits DNA amplification so concentration is critical • Detects specific and non-specific targets • Low starting background with large increase in signal • Can run a melt curve to look at product specificity

17. Detecção com sondas

18. Quimicas utilizáveis:sondas taqman

19. 3’ 5’ R Q Q R Excitation Excitation R Q R Q 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ Sequence specific probes: Dual labeled probes

20. Quimicas utilizáveis:molecular beacons

21. DabCyl FAM 10mer 25mer Molecular Beacons I

22. Excitation R Q Q Emission R Q R Molecular Beacons II X

23. Excitation R Q Q Emission R Q R Molecular Beacons II X

24. Molecular Beacons III • Can be used to quantitation and mutation detection • Need beacons for the normal and mutation sequence • Design is difficult due to nature of folding structure • Expensive when compared to FRET

25. Quimicas utilizáveis:sondas FRET

26. Transfer Excitation Emission Hyb-ProbesTM Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher Prof.Doutor José Cabeda

27. 5’ 3’ Quenched FRET analysis • Two labeled probes, FAM at the 5’ and BH1 on the 3’ • When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1 • After the product is amplified run a melt curve to determine genotype • Different melt points are seen for normal and mutation

28. MGB MGB F F F F F Q Q Q Q Quimicas utilizáveis:sondas Eclipse

29. Aplicações Quantificação Prof.Doutor José Cabeda

30. End Point versus Real-Time

31. Quantificação

32. Aplicações Detecção de Mutações / SNP Prof.Doutor José Cabeda

33. Detecção de mutações

34. Aplicações Multiplex Detection Prof.Doutor José Cabeda

35. Detecção simultânea de vários produtos

36. Os equipamentos Prof.Doutor José Cabeda

37. Light Cycler

38. Smartcycler

39. Rotorgene • The samples spin continually during a run at 500 rpm • The samples are heated and cooled in a low mass air oven • Tubes are illuminated as they pass the detector • On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample • Four Channels • Ch1: ex 470nm, det 510nm • Ch2: ex 530nm, det 550nm • Ch3: ex 585nm, det 610nm • Ch4: ex 625nm, det 660nm

40. O Futuro próximo

41. Detecção com sondas

42. Detcção com SybGreen

43. Quantificação

44. Detecção de mutações

45. Detecção simultânea de dois produtos

46. Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos • PCR • Real Time PCR • NASBA/TMA

47. NASBA/NUCLISENS

48. Amplification: schematic diagram Primer 1 Legend: Reverse Transcriptase • sense RNA • antisense RNA • sense DNA • antisense DNA RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase T7 RNA polymerase Primer 2 Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase RNase H Primer 1

49. Técnicas de amplificação de Sinal • bDNA (Quantiplex)

50. bDNA (I)