S.I.Mi.S.A
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S.I.Mi.S.A. Stato avanzamento lavori SAL I – II - III. Il Progetto. S.I.Mi.S.A . “Strumenti Innovativi per il Miglioramento della Sicurezza A limentare”. BUDGET Ricerca Industriale: 5.901.965 € Sviluppo Sperimentale: 1.337.462 € Formazione : 1.037.175 €.

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Presentation Transcript


S i mi s a

S.I.Mi.S.A.

Stato avanzamento lavori SAL I – II - III


Il progetto

Il Progetto

S.I.Mi.S.A.

“Strumenti Innovativi per il Miglioramento della Sicurezza Alimentare”

BUDGET

Ricerca Industriale: 5.901.965 €

Sviluppo Sperimentale:1.337.462 €

Formazione: 1.037.175 €

Responsabile scientifico: Dott. Angelo Visconti


Obiettivo generale

Obiettivo Generale

L’obiettivo generale del progetto è la messa a punto di strumenti innovativi e affidabili per intervenire a livello di:

PREVENZIONE – CONTROLLO – CORREZIONE della contaminazione

al fine di contribuire alla realizzazione di un sistema integrato di sicurezza lungo tutta la filiera.

Keyfoods pugliesi: uva e vino, frumento e altri cereali e derivati, ed un insieme di prodotti freschi quali molluschi bivalvi, carni bovine, mozzarella e prodotti ortofrutticoli.

  • Selezionati in base a:

  • rischio di contaminazione da differenti classi di contaminanti,

  • valenza economica e territoriale,

  • livello di interesse scientifico in termini di applicazione di tecnologie innovative.


Problematiche tecnico scientifiche

Problematiche Tecnico-scientifiche

Filiera

viti-vinicola

Filiera

CEREALICOLA

PRODOTTI

FRESCHI

  • Ocratossina A

  • Fitofarmaci

  • Allergeni

  • Brettanomyces

  • bruxellensis

  • Micotossine

  • Fitofarmaci

  • Funghi tossigeni

  • Bacilli

  • Insetti

  • Metalli pesanti

  • Pseudomonasspp.

  • Patogeni emergenti

  • Listeria

  • Salmonella

Limiti imposti dalle normative – Esigenze reali delle imprese

RISULTATI ATTESI:

Metodi rapidi e avanzati per la rivelazione di contaminanti chimici.

Nuovi metodi per il rilevamento di microrganismi patogeni e alteranti.

Acquisizione di nuove conoscenze

Trasferimento tecnologico – Scale up industriale


Struttura del progetto di ricerca

Struttura del Progetto di Ricerca


Avanzamento rendicontazione per or sal i ii iii

% Avanzamento Rendicontazione per OR SAL I - II - III


Avanzamento rendicontazione per os sal i ii iii

% Avanzamento Rendicontazione per OS SAL I - II - III


Attivit preliminari

Attività preliminari


Avanzamento os 2 1 os 4 1

Avanzamento OS 2.1/ OS 4.1


Avanzamento os 6 1 7 2

Avanzamento OS 6.1//7.2


S i mi s a

OR 1 – Strumenti Preventivi Innovativi per la Riduzione del Rischio di Microrganismi Alteranti in Vino

OS 1.1: Messa a punto di un protocollo biotecnologico per minimizzare lo sviluppo di lieviti del genere Brettanomyces e per ridurre la produzione e la presenza di etilfenoli nel vino

Partner:

  • Università degli Studi di Foggia - Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell’Ambiente (SAFE)

  • ISPA-CNR (Lecce)

    Soggetto attuatore:

  • D.A.Re. scrl


Avanzamento os 1 1

Avanzamento OS 1.1


Stato di avanzamento delle attivit al 30 04 2013

Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)

  • Task 1.1.1: Sviluppo di metodiche biotecnologiche e cromatografiche per l'analisi delle dinamiche microbiche di Brettanomycesbruxellensis (M1-12)

    - stato: completato

  • Task 1.1.2: Studio dell’influenza dei parametri fisico-chimici relativi alle vinificazioni aziendali sullo sviluppo di diversi ceppi di Brettanomyces bruxellensis isolati da vini pugliesi e sulla connessa produzione di etil-derivati (M5-25)

    - stato: in corso (50% completamento)

  • Task 1.1.3: Studio di strategie di riduzione del rischio da Brettanomyces bruxellensis e definizione di un protocollo di prevenzione (M9-27)

    - stato: in corso (35% completamento)


Risultati principali task 1 1 1 unifg cnr

Risultati Principali – Task 1.1.1 (UNIFG, CNR)

  • Task 1.1.1: Sviluppo di metodiche biotecnologiche e cromatografiche per l'analisi delle dinamiche microbiche di Brettanomycesbruxellensis

  • Selezione di ceppi di Brettanomyces bruxellensis in vini pugliesi e validazione della metodica molecolare per l’identificazione e quantificazione rapida di B. bruxellensis in vino

  • Ottimizzazione di un metodo basato sull’applicazione dell’ HPLC per la quantificazione degli acidi idrossicinnamicie dei corrispondenti vinil- ed etil-derivati in vino


Risultati principali task 1 1 2 unifg cnr

Risultati Principali – Task 1.1.2 (UNIFG, CNR)

  • Task 1.1.2: Studio dell’influenza dei parametri fisico-chimici relativi alle vinificazioni aziendali sullo sviluppo di diversi ceppi di Brettanomycesbruxellensis isolati da vini pugliesi e sulla connessa produzione di etil-derivati

  • Studio sulla relazione tra sviluppo di B. bruxellensis, produzione di etilderivati, e diversi parametri chimico-fisici specifici delle vinificazioni svolte presso le aziende proponenti

  • Analisi del trascrittoma di un ceppo di B. bruxellensisaccresciuto in mosto-vino


Risultati principali task 1 1 3 unifg cnr

Risultati Principali – Task 1.1.3 (UNIFG, CNR)

  • Task 1.1.3: Studio di strategie di riduzione del rischio da Brettanomycesbruxellensis e definizione di un protocollo di prevenzione

  • Protocollo di gestione delle risorse microbiche per la riduzione di B. bruxellensis e di fenoli volatili (etil-derivati) da esso prodotti.

  • Protocollo di utilizzo delle scorze cellulari di lieviti per la riduzione dei fenoli volatili (etilderivati) prodotti da B. bruxellensisin vino.


Or 2 strumenti di controllo innovativi per la determinazione di contaminanti in uva e vino

OR 2 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Uva e Vino

  • OS 2.2: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni nel vino

    Partner:

  • ISPA-CNR (Bari)

    Soggetto attuatore:

  • D.A.Re. scrl


Avanzamento os 2 2

Avanzamento OS 2.2


Stato di avanzamento delle attivit al 30 04 20131

Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)

  • Task 2.2.1: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni in vini chiarificati (M1-36)

  • - stato: in corso (60% di completamento)

  • Task 2.2.2: Sviluppo di un immunosaggio basato su SPR per la determinazione di allergeni di latte e uova in vini chiarificati (M7-36)

  • - stato: in corso (20% di avanzamento)


Risultati principali task 2 2 1 ispa cnr

Risultati Principali - Task 2.2.1 (ISPA-CNR)

  • Task 2.2.1: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni in vini chiarificati

    Attività 2.2.1.a - Sviluppata con successo una metodica sensibile e affidabile per la simultanea estrazione e purificazione di allergeni di latte e uovo in vini bianchi chiarificati con caseinati (chiarificante A) e bianco d’uovo (chiarificante B)

    Attività 2.2.1.b - Ottimizzate le condizioni di separazione ed analisi dei peptidi derivanti dall’idrolisi enzimatica della componente allergenica tramite HPLC-spettrometria di massa ad alta risoluzione

    Attività 2.2.1c - Almeno due proteine allergeniche rivelate (alfa caseina e beta caseina per agente A; ovalbumina e lisozima per agente B) ed almeno due peptidi identificati per ciascun allergene in campioni di vino chiarificato. Limiti di rivelabilità raggiunti con il metodo HPLC-MS/MS sviluppato: < 1 µg/mL

    Monaci et al, Multiallergenquintification of fining-relatedegg and milkproteins in whitewines by high-resolution-mass-spectrometry. RapidCommun. Mass. Spec. 2013,27,2009-18.

Trattamento

bioinformatico

Pretrattamento

Vino chiarificato

Allergene

Idrolisi enzimatica

Analisi HPLC-HRMS


S i mi s a

  • Risultati Principali- Task 2.2.2 (ISPA-CNR)

  • Task 2.2.2: Sviluppo di un immunosaggio basato su SPR per la determinazione di allergeni di latte e uova in vini chiarificati

  • Valutazione di chip diversamente modificati e di diverse tipologie di anticorpi (mono e policlonali) mirati alla messa a punto di un immunosensore SPR per la rivelazione di allergeni di uovo

  • Ottimizzazione delle condizioni d’immobilizzazione (pH, forza ionica) dell’anticorpo biotinilato prescelto per la sua immobilizzazione indiretta su biochip di oro modificati con streptavidina.

Immunosensore SPR


Or 2 strumenti di controllo innovativi per la determinazione di contaminanti in uva e vino1

OR 2 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Uva e Vino

OS 2.3: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in uva e vino e produzione di materiali di riferimento

OS 5.1: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in cereali, produzione di miscele standard e materiali di riferimento

Partner:

  • Lab. Instruments srl

  • ISPA-CNR (Bari)

    Soggetto attuatore:

  • D.A.Re. scrl

  • LE ATTIVITA’ DELL’OS 2.3 SONO SVOLTE CONGIUNTAMENTE A QUELLE DELL’OS 5.1


Or 3 strumenti correttivi innovativi per la rimozione di metaboliti microbici indesiderati nel vino

OR 3 – Strumenti Correttivi Innovativi per la Rimozione di Metaboliti Microbici Indesiderati nel Vino

OS 3.1: Messa a punto di un prototipo per la rimozione dell’ocratossina A (OTA) nel vino mediante la tecnica del ripasso continuo su vinacce/buccette

Partner:

  • ISPA-CNR (Bari)

  • Industrie Fracchiolla srl

    Soggetto attuatore:

  • D.A.Re. scrl


Avanzamento os 3 1

Avanzamento OS 3.1


Stato di avanzamento delle attivit al 30 04 20132

Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)

  • Task 3.1.1 – Reperimento di vinacce esenti da OTA e di partite di mosti/vini naturalmente contaminati da OTA

    - stato: in corso (10% completamento)

  • Task 3.1.2 – Stabilizzazione delle vinacce

    - stato: in corso (20% completamento)

  • Task 3.1.4 – Sviluppo di un prototipo per il ripasso in continuo su vinacce e/o loro componenti

    - stato: in corso (20% completamento)


Risultati principali

Risultati Principali

  • Task 3.1.1: Reperimento di vinacce esenti da OTA e di partite di mosti/vini naturalmente contaminati da OTA

  • Task 3.1.2: Stabilizzazione delle vinacce

  • Task 3.1.4: Sviluppo di un prototipo per il ripasso in continuo su vinacce

  • Le vinacce (cv amarone) sono state reperite presso il centro di ricerca per la viticoltura di Conegliano (CRA).

  • È stata stimata la carica microbica batterica e fungina iniziale mediante conta in piastra:

    3,2·105 UFC/g (concentrazione batterica)

    2,2·106UFC/g (concentrazione fungina)

  • È stato valutato l’effetto delle diverse condizioni di stabilizzazione (°C, SO2, tempo) sulla carica batterica e

    fungina

  • È stata misurata la concentrazione di OTA:

    3,1 ± 0,2 µg/kg OTA

  • È stato ideato (ISPA, Ind. Fracchiolla e consulente enologo) e realizzato (Ind. Fracchiolla) il primo prototipo per le prove di ripasso


Risultati principali task 3 1 2 ispa cnr

Risultati Principali – Task 3.1.2 (ISPA-CNR)

Popolazionebattericapresente nelle vinacce conservate a differenti temperature ed in presenza o assenza di SO2


Risultati principali task 3 1 2 ispa cnr1

Risultati Principali – Task 3.1.2 (ISPA-CNR)

Popolazione fungina nelle vinacce conservate a differenti temperature ed in presenza o assenza di SO2


Risultati principali task 3 1 4 industrie fracchiolla ispa cnr

Risultati Principali – Task 3.1.4 (Industrie Fracchiolla, ISPA-CNR)

  • Sono stati condotti incontri di lavoro tra personale dell’ISPA-CNR, dell’Industrie Fracchiolla e dell’enologo coinvolto nell’attività progettuale per l’ideazione, la progettazione e la realizzazione di un miniprototipo da laboratorio per le prove di ottimizzazione delle condizioni e modalità di ripasso di vino contaminato da OTA su vinacce incontaminate


Or 3 strumenti correttivi innovativi per la rimozione di metaboliti microbici indesiderati nel vino1

OR 3 – Strumenti Correttivi Innovativi per la Rimozione di Metaboliti Microbici Indesiderati nel Vino

OS 3.2: Sviluppo di metodologie bio-molecolari per la decontaminazione/degradazione dell’ocratossina A (OTA) nei mosti-vini

Partner:

  • ISPA-CNR (Bari)

  • ISPA-CNR (Lecce)

  • IBBE-CNR

    Soggetto attuatore:

  • D.A.Re. scrl


Avanzamento os 3 2

Avanzamento OS 3.2


Stato di avanzamento delle attivit al 30 04 20133

Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)

  • Task 3.2.1: Isolamento e caratterizzazione di popolazioni microbiche in grado di degradare l'OTA (M1-24)

    • stato: in corso (65 % completamento)

  • Task 3.2.2: Identificazione di geni codificanti gli enzimi correlati alla degradazione di OTA in isolati microbici naturali (M7-34)

    • stato: in corso(40 % completamento)


Risultati principali task 3 2 1 ispa cnr

Risultati Principali - Task 3.2.1 (ISPA CNR)

  • Attività 3.2.1.a - Individuazione dei campi e campionamento

    Sono stati individuati 4 vigneti rappresentativi dell’areale di coltivazione delle varietà Negroamaro e Primitivo.

    Sono stati effettuati campionamenti di terreno, tralci e grappoli.

  • Attività 3.2.1.b - Analisi chimica

    E’ statamessa a puntounametodicaanalitica per la determinazionesimultanea di OTA e OTalphanei diversi substrati liquidi mediante HPLC/FLD.

  • Attività 3.2.1.c - Analisi microbiologica

    Due fermentazioni spontanee, effettuate utilizzando le uve Negroamaro e Primitivo sono state campionate durante 5 fasi del processo.

    E’ stata studiata la dinamica di popolazione di lieviti in vinificazione spontanee.

    Sono stati isolati e identificati 35 ceppi di lievito per ciascuna delle 5 fasi

    E’ stata indagata la capacità di degradare OTA da parte di 96 ceppi di batteri malolattici.


Risultati principali task 3 2 2 ispa cnr ibbe cnr

Risultati Principali - Task 3.2.2 (ISPA CNR, IBBE CNR)

  • Attività 3.2.2.a - Messa a punto di metodiche estrazione di DNA e RNA dai campioni di mosto

    Il metodo di estrazione di DNA messo a punto consente, partendo da matrici complesse derivate dalla filiera vitivinicola, di ottenere materiale genetico appartenente a microrganismi anche molto distanti dal punto di vista tassonomico (procarioti ed eucarioti).

CAMPIONE

Estrazione del DNA appartenente all’intera comunità microbica

Screening di particolari marcatori genetici di specie che sono selettivamente sequenziati

Il metodo sviluppato prevede l’associazione di un kit commerciale di estrazione del DNA da suolo (FAST DNA kit for soil della DBA Italia) con una serie di trattamenti sviluppati per eliminare le impurità e, quindi, aumentare la resa di estrazione e successiva amplificazione di marcatori genetici per la creazione di librerie di sequenziamento NGS.

Sequenziamentosuvastascaladell’interometagenoma o metatrascrittoma

Caratterizzazione bioinformatica della complessità genetica e tassonomica della comunità microbica


Risultati principali task 3 2 2 ispa cnr ibbe cnr1

Risultati Principali - Task 3.2.2 (ISPA CNR, IBBE CNR)

  • Attività 3.2.2.a - Messa a punto di metodiche estrazione di DNA e RNA dai campioni di mosto : RISULTATI

Acqua di lavaggio dei grappoli

Estrazione del metagenoma

Mosto ad inizio fermentazione

1500 bp

1000

250

Acqua di lavaggio dei grappoli

Mosto


S i mi s a

Amplificazione del marcatore tassonomico fungino:

rDNAITS1-5.8S-ITS2

its1

5.8S

rDNA

18S rDNA

ITS1

ITS2

its4

28S rDNA

M 11

Dimensione attesa dell’amplicone

PrimersITS1/ITS4: 5’-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3’/5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

Cavalieri, D. et al (2003). J. Mol. Evol., 57, S226–S232.

400-900 pb

(variabile in relazione alla specie)

1500 bo

1000

750

500

250

Amplificazione del marcatore tassonomico batterico:

Gene codificante per l’rRNA 16S

M 11

16Sr

16Sd

Dimensione attesa dell’amplicone

Primers 16Sd/16Sr: 5’-GCTGGCGGCATGCTTAACACAT-3’/5’-GGAGGTGATCCAGCCGCAGGT-3’

Ruiz, A. et al (2000 Int. J. Syst. Evol. Micr., 50, 1981-1987.

1500 pb


Or 5 strumenti di controllo innovativi per la determinazione di contaminanti in cereali e derivati

OR 5 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Cereali e Derivati

OS 2.3: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in uva e vino e produzione di materiali di riferimento

OS 5.1: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in cereali, produzione di miscele standard e materiali di riferimento

Partner:

  • Lab. Instruments srl

  • ISPA-CNR (Bari)

    Soggetto attuatore:

  • D.A.Re.scrl


Avanzamento os 2 3

Avanzamento OS 2.3


Avanzamento os 5 1

Avanzamento OS 5.1


Stato di avanzamento delle attivit al 30 04 20134

Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)

  • Task 2.3.1 - Studio di fattibilità, sviluppo di materiali di riferimento (RM) e loro certificabilità per l’analisi multi residuale di fitofarmaci nella matrice vino mediante strumenti di controllo innovativi (M1-36)

    • stato: in corso (50% completamento)

  • Task 2.3.2 - Sviluppo e validazione di metodiche multiresiduali in alta risoluzione (LC-HRMS) per la determinazione di fitofarmaci untargeted nel vino (M7-36)

    • stato: in corso (20% completamento)


Stato di avanzamento delle attivit al 30 04 20135

Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)

  • Task 5.1.1: Individuazione delle sottoclassi di fitofarmaci, studio dell’effetto matrice (frumento) sull’analisi strumentale di fitofarmaci, di solubilità, stabilità ed allestimento delle aliquote da destinare al proficiency test (M1-30)

    • stato: in corso (50% completamento)

  • Task 5.1.2: Sviluppo e confronto di metodiche di rivelazione basate sull’uso di spettrometri di massa ad alta risoluzione (untargetedanalysis) e spettrometri a triplo quadrupolo (targetedanalysis) (M7-36)

    • stato: in corso (20% completamento)


Risultati principali task 2 3 1 e 5 1 1 lab instruments

Risultati Principali – Task 2.3.1 e 5.1.1 (Lab.Instruments)

  • Task 2.3.1 e Task 5.1.1: studio di fattibilità e sviluppo di materiali di riferimento

  • Materiali di riferimento in soluzione standard

  • Approvvigionamento

  • Allestimento di soluzioni di singoli fitofarmaci e caratterizzazione delle caratteristiche chimico-fisiche e redazione di “schede prodotto” (circa 220)

  • Individuazione di sottoclassi da raggruppare in miscele

  • Allestimento di miscele

  • Avviamento dell studio di stabilità delle miscele


Risultati principali task 2 3 2 e 5 1 2 lab instruments

Risultati Principali - Task 2.3.2 e 5.1.2 (Lab.Instruments)

  • Task 2.3.2 e Task 5.1.2: studio di fattibilità e sviluppo di materiali di riferimento

  • Materiali di riferimento in matrice

  • Raccolta di informazioni in merito all’utilizzo cultivar-specifico di fitofarmaci

  • Screening e caratterizzazione delle matrici “bianche” per l’allestimento di materiali di riferimento

  • Da un set di 20 campioni di VINO BIANCO (circa 2 L per campione) raccolti da produttori privati sono stati selezionati 8 campioni con tenore di fitofarmaci inferiore al limite di rivelabilità

  • E’ un corso la caratterizzazione di un set di 20 campioni di FRUMENTO (duro e tenero) provenienti dal mercato locale


Risultati principali1

Risultati Principali

ESEMPIO: miscelaformulata per essereinclusanellamatrice VINO


Risultati principali task 2 3 2 e 5 1 2 lab instruments1

Risultati Principali - Task 2.3.2 e 5.1.2 (Lab.Instruments)

  • Task 2.3.2 e Task 5.1.2: sviluppo di metodiche multiresiduali basate sulla spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS)

  • Ottimizzazione delle condizioni strumentali (rivelazione in HRMS e MS/MS) mediante analisi delle soluzioni di fitofarmaci allestite nell’ambito delle Tasks 2.3.1 e 5.1.1.

  • Sviluppo di procedure di preparazione del campione (QuEChERs sviluppati dalla LabInstrument s.r.l.)


Or 5 strumenti di controllo innovativi per la determinazione di contaminanti in cereali e derivati1

OR 5 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Cereali e Derivati

OS 5.2: Messa a punto di una metodica multi-micotossina in cereali e derivati e produzione di materiali di riferimento

Partner:

  • ISPA-CNR (Bari)

  • Lab. Instruments srl

    Soggetto attuatore:

  • D.A.Re. scrl


Avanzamento os 5 2

Avanzamento OS 5.2


Stato di avanzamento delle attivit al 30 04 20136

Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)

  • Task 5.2.1: Produzione di materiali di riferimento (farine di frumento e mais) multi-micotossina (M1-36)

    • stato: in corso (50% completamento)

  • Task 5.2.2: Sviluppo di metodichemultianalita LC-MS(MS) per micotossine in cereali e prodottiderivati (M1-36)

    • stato: in corso (50% completamento)


Risultati principali task 5 2 1 ispa cnr

Risultati Principali- Task 5.2.1 (ISPA-CNR)

  • Task 5.2.1: Produzione di materiali di riferimento (farine di frumento e mais) multi-micotossina

Per i livelli target ci si è riferiti ai regolamenti 1881/2006/EC (aflatossine e OTA), 1126/2007/EC (DON, ZEA, fumonisine) e alla raccomandazione 2013/165/EU (somma di T-2 e HT-2) delle quali sono stati considerati i limiti massimi stabiliti per frumento e mais destinati al consumo umano diretto.


Risultati principali task 5 2 1 ispa cnr1

Risultati Principali – Task 5.2.1 (ISPA-CNR)

MAIS naturalmente contaminato da

DON, FB1, FB2 (30 kg)

Studio di

OMOGENEITA’

STABILITA’

Estratti da colture di

F. sporotrichioides (T2-HT2)

F. gramienarum (DON-ZEA)

flavus (AFs)

A. parasiticus (AFs)

A. ochraceous (OTA)

Miscelazione e

omogeneizzazione

Suddivisione in aliquote da 80 g

  • La stessa strategia è stata utilizzata per la produzione del FRUMENTO contaminato da tossine di Fusarium e OTA


Risultati principali task 5 2 2 ispa cnr

Risultati Principali – Task 5.2.2 (ISPA-CNR)

  • Task 5.2.2: Sviluppo di metodichemultianalita LC-MS(MS) per micotossine in cereali e prodottiderivati


Risultati principali task 5 2 2 ispa cnr1

Risultati Principali – Task 5.2.2 (ISPA-CNR)

NIV

DON

AFB1, B2, G1, G2

OTA

FB1, FB2

OTA

ZEA

T-2, HT-2

Analisi

LC-MS/MS

Frumento

Mais

Snack a base di mais

Cereali per colazione

Estrazione sequenziale

acqua e metanolo

(4 min)

Purificazione su IAC

MULTI-ANTICORPO

3-/15-AcDON

DON-3-glucoside

HT-2/T-2-glucoside

APPROCCIO

ALTERNATIVO

Analisi

LC-HRMS

PHFBs, HFBs

…altrimetaboliti….

Purificazione su

colonnine SPE


Or 5 strumenti di controllo innovativi per la determinazione di contaminanti in cereali e derivati2

OR 5 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Cereali e Derivati

OS 5.3: Messa a punto di una metodica analitica unica per la determinazione di fitofarmaci e micotossine in cereali e derivati

Partner:

  • BonassisaLabsrl

  • Università degli Studi di Foggia, Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e dell’Ambiente (SAFE)

    Soggetto attuatore:

  • D.A.Re. scrl


Avanzamento os 5 3

Avanzamento OS 5.3


Stato di avanzamento delle attivit al 30 04 20137

Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)

  • Task 5.3.1: Sviluppo di una metodica unica per la determinazione di fitofarmaci e micotossine in cereali e derivati (M3-36)

  • stato: in corso (42% completamento)


Risultati principali task 5 3 1 bonassisalab

Risultati Principali – Task 5.3.1 (BonassisaLab)

I principali risultati scientifici:

  • Implementazione, validazione e accreditamento di un metodo per la determinazione di micotossine su filiera cerealicola:

    10 g campione – estrazione con miscela acetonitrile/acqua/acido acetico in rapporto 1:2– nessuna fase di purificazione – analisi in LCMSMS

  • Implementazione, validazione di un metodo per la determinazione di residui di fitofarmaci in cereali e derivati:

    10 g campione – estrazione con acetonitrile acqua – purificazione con SPE – analisi LCMSMS e GCMSMS

  • Sviluppo di una metodica unica per la determinazione di micotossine e pesticidi

    10 g campione estrazione con miscela acetonitrile/acqua formiata (5mMol ) – analisi LCMSMS e GCMSMS


Risultati principali task 5 3 1 bonassisalab1

Risultati Principali – Task 5.3.1 (BonassisaLab)

  • Metodo multi-micotossina LC/MSMS:

  • Determinazioneditutte le 11 micotossinenormatenel REG CE 1881/2006

  • (aflatossine, ocratossina A, deossinivalenolo, zearalenone, tossine T-2 e HT-2, fumonisine)

RISULTATI DELLA VALIDAZIONE

In conformità al Reg. CE 401/2006 sonostativalutatiicriteridirendimento del metodo per ciascunamicotossina, pertanto è statacalcolatasia la deviazione standard relativa (RSDr ), calcolata a partiredairisultatiottenuti in condizionediripetibilità, siailrecuperoattraversoun’aggiunta in matrice.

CRITERIO DI IDONEITA’ ALLO SCOPO

Il laboratorio ha verificatoun’incertezzamassima standard adeguata per tutte le micotossine


Risultati principali task 5 3 1 bonassisalab2

Risultati Principali – Task 5.3.1 (BonassisaLab)

  • Metodo LC-MS/MS per la determinazionedi 270 fitofarmaci

Validazione del metodo in accordo con:

Document No. SANCO/10684/2009

METHOD VALIDATION AND

QUALITY CONTROL PROCEDURES

FOR PESTICIDE RESIDUES ANALYSIS IN FOOD AND FEED


Risultati principali task 5 3 1 bonassisalab3

Risultati Principali – Task 5.3.1 (BonassisaLab)

  • Multi GC/MSMS: metododa 350 molecole


Or 5 strumenti di controllo innovativi per la determinazione di contaminanti in cereali e derivati3

OR 5 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Cereali e Derivati

OS5.4: Sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di micotossine in cereali e derivati

Partner:

  • ISPA-CNR (Bari)

  • MoliniTandoiSpa

    Soggetto attuatore:

  • D.A.Re. scrl


Avanzamento os 5 4

Avanzamento OS 5.4


Stato di avanzamento delle attivit al 30 04 20138

Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)

  • Task 5.4.1: Messa a punto di immunosaggi a polarizzazione di fluorescenza (FP) per la determinazione di OTA, DON e tossine T-2 e HT-2 in cereali e prodotti derivati (M1-30)

    • stato: in corso (60% completamento)

  • Task 5.4.2: Messa a punto di un saggio lateral flow (LF) per la determinazione di OTA in cereali e prodotti derivati (M13-36)

    • stato: in corso (15% completamento)

  • Task 5.4.3: Messa a punto di metodi di spettroscopia nel vicino infrarosso (FT-NIR) per la determinazione semi-quantitativa/qualitativa di DON e OTA in cereali e prodotti derivati (M3-36)

    • stato: in corso (30% completamento)

  • Task 5.4.4: Messa a punto di un metodo basato sul naso elettronico con tecnologia MOS per la determinazione di DON e OTA in cereali e prodotti derivati (M5-36)

    • stato: in corso (40% completamento)


Risultati principali task 5 4 1 ispa cnr

Risultati Principali – Task 5.4.1 (ISPA-CNR)

  • Attività 5.4.1.a – Sintesi e isolamento di derivatifluorescenti (traccianti) dellemicotossine:

  • Sonostatisintetizzati, isolatie caratterizzatiitraccianti(1 per il DON, 4 per T-2 e HT-2 e 1 per OTA).

  • Obiettivo intermedio a 12 mesi (almeno 1 tracciante per tossina): raggiunto

  • Attività 5.4.1.b – Studio dell’interazione tracciante-anticorpo e messa a punto di un metodo competitivo in soluzione

  • Sonostatisviluppatitreimmunosaggicompetitiviper la determinazione di DON, T-2+HT-2 e OTA in soluzione.


Risultati principali task 5 4 1 ispa cnr1

Risultati Principali – Task 5.4.1 (ISPA-CNR)

  • Attività 5.4.1.c – Sviluppo di un protocollo di estrazione compatibile con l’immunosaggio e valutazione delle performance analitiche dell’immunosaggio FP

  • E’ statosviluppato e validato un immunosaggio FP per la determinazione di OTA in frumento.

Lippolis V., Pascale M., Valenzano S., Porricelli A.C.R., Suman M. and Visconti A. (2013), Food Analytical Methods,DOI 10.1007/s12161-013-9627-3


Risultati principali task 5 4 2 ispa cnr

Risultati Principali – Task 5.4.2 (ISPA-CNR)

  • Attività 5.4.2.a - Messa a punto di un saggio LF basato sull’utilizzo dell’aptamero per la determinazione di OTA in soluzione

  • E’ statavalutatal’affinità di 7 diversiaptameri per l’OTA.


Risultati principali task 5 4 3 ispa cnr molini t andoi

Risultati Principali – Task 5.4.3 (ISPA-CNR, Molini Tandoi)

  • Attività 5.4.3.a - Selezione di campioni di cereali e prodotti derivati naturalmente contaminati previa analisi con metodo analitico di riferimento

  • Sonostatianalizzatimediantemetodi HPLC di riferimento:

  • 186 campionidifrumentoduronaturalmentecontaminatida DON (105 selezionati att. 5.4.4.a);

  • 37 campionidicruscadifrumentoduronaturalmentecontaminatida DON;

  • 9 campionidifarinacciodifrumentoduronaturalmentecontaminatida DON;

  • 20 campionidifrumentoduronaturalmentecontaminatida OTA.

  • Attività 5.4.3.b - Sviluppo di rette di calibrazione e di modelli discriminanti FT-NIR specifici per ciascuna micotossina e matrice selezionata

  • Sonostaticostruiti un modelloquantitativo (retta PLS) e un modelloqualitativo (modellodiscriminante) per la predizione del contenuto di DON in campioni di crusca di frumentoduro.


Risultati principali task 5 4 4 ispa cnr

Risultati Principali – Task 5.4.4 (ISPA-CNR)

  • Attività 5.4.4.a - Calibrazione del naso elettronico per la classificazione di campioni di cereali e prodotti derivati a differente contenuto di DON e OTA

  • E’ stato sviluppato un modello di calibrazione per la discriminazione di campioni di frumento duro a differente contenuto di DON mediante naso elettronico a tecnologia MOS.

Analisi DFA*

Analisi (n=525)

105 campioni (macinato)

Classe A ([DON, µg/kg]<1000) - Campioni conformi

Classe B (1000 ≤ [DON, µg/kg] ≤ 2500) - Campioni all’analisi di conferma

Classe C ([DON, µg/kg]>2500) - Campioni non conformi


Or 6 strumenti innovativi per la prevenzione del rischio di contaminazione di prodotti freschi

OR 6 – Strumenti Innovativi per la Prevenzione del rischio di Contaminazione di Prodotti Freschi

OS 6.2: Impiego di compost e strategie agronomiche innovative per ridurre il contenuto di metalli pesanti nelle produzioni orticole da consumo fresco

Partner:

  • ISPA-CNR (Bari)

  • UniversitàdegliStudi di Bari – Dipartimento di Scienze del Suolo, dellaPianta e degliAlimenti (DiSSPA)

    Soggetto attuatore:

  • D.A.Re. scrl


Avanzamento os 6 2

Avanzamento OS 6.2


Stato di avanzamento delle attivit al 30 04 20139

Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)

  • Task 6.2.1: Individuazione e valutazione di differenti compost idonei all’impiego come substrati di coltivazione e/o ammendanti in orticoltura (M13-35)

    • stato: in corso (60% completamento)


Risultati principali task 6 2 1 ispa cnr uniba

Risultati Principali – Task 6.2.1 (ISPA-CNR, UNIBA)

  • Task 6.2.1: Individuazione e valutazione di differenti compost idonei all’impiego come substrati di coltivazione e/o ammendanti in orticoltura

  • Saggi di fitotossicità su compost: 4/10 – ISPA.

  • I saggi di fitotossicità, al momento della presentazione del report, hanno presentato tutti valori > 60 % di germinabilità (valore imposto dalla legge).

  • Analisi fisiche sui compost: 4/10 – ISPA.


Risultati principali task 6 2 1 ispa cnr uniba1

Risultati Principali Task 6.2.1 (ISPA-CNR, UNIBA)

  • Analisichimichedeimetallipesanti sui compost: 8/10 – DiSSPA

  • Contenuto medio di metalli nei compost analizzati (mg kg-1 peso secco)

* Determinati mediante ICP-OES; °determinati mediante XRF;n.d.: non rilevabile


S i mi s a

OR 7 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Metalli Pesanti e Microrganismi Patogeni in Prodotti Freschi

OS7.1: Sistemi innovativi per la diagnosi rapida di metalli pesanti in prodotti freschi

Partner:

  • ISPA-CNR (Lecce)

  • Università del Salento, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali (DiSTeBA)

  • Biotecgens.r.l.

    Soggetto attuatore:

  • D.A.Re. scrl


Avanzamento os 7 1

Avanzamento OS 7.1


Stato di avanzamento delle attivit al 30 04 201310

Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)

  • Task 7.1.1: Messa a punto di sistemi innovativi per la rivelazione di metalli pesanti in matrici alimentari mediante la spettroscopia ATR-FTIR e microbilance piezoelettriche (M1-36)

    • stato: in corso (50% completamento)


Risultati principali t ask 7 1 1 unisalento ispa cnr

Risultati Principali – Task 7.1.1 (UNISALENTO, ISPA-CNR)

  • Attività 7.1.1.a - Spettroscopia IR su prodotti freschi

  • Sono state condotte misure atte a testare la validità del protocollo per l’estrazione di metalli pesanti da matrici alimentari messo a punto dall’unità di ricerca del CNR ISPA di Lecce al fine di effettuare le indagini mediante spettroscopia IR per lo studio dei segnali differenziali derivanti dalla decomplessazione dei gruppi ligandi.

  • Sono stati testati diversi protocolli sperimentali per la definizione della composizione chimica, della temperatura e del pH delle soluzioni per il trattamento di alimenti da sottoporre ad analisi ATR-FTIR differenziale.

  • Messa a punto di un dispositivo per le indagini mediante spettroscopia IR in modalità differenza sui campioni ottenuti. In questo modo è stato possibile ottenere ciclicamente la decomplessazione dei metalli e la contemporanea acquisizione di spettri differenza (legato meno non legato), in maniera tale da evidenziare i segnali IR associati ai cambiamenti di singoli gruppi funzionali coinvolti nel binding.

A

B


Risultati principali task 7 1 1 unisalento ispa cnr

Risultati Principali – Task 7.1.1 (UNISALENTO, ISPA-CNR)

  • Attività 7.1.1.b - Spettroscopia IR su materiali idrofobici ad alta affinità per gli ioni metallici tossici :

  • Le attività hanno riguardato lo studio di materiali ad alta affinità e selettività per ioni metallici tossici (nichel, cobalto, cromo, cadmio), idonei alla preparazione di strati attivi stabili e la definizione di parametri analitici (sensibilità, selettività, ecc.) di sensori chimici a trasduzione ottica nel range IR basati sugli strati attivi selezionati.

  • Sono state eseguite indagini per l’identificazione degli strati attivi caratterizzati dai migliori parametri di sensibilità, stabilità, rapidità, riutilizzabilità e selettività.

  • In particolare è stato visto che i leganti azotati, quali NH e CN piridinici, possono essere utilizzati nel binding specifico di nichel e cadmio, monitorato mediante spettroscopia IR. Sono in corso altre analisi per l’individuazione di ulteriori strati attivi per il legame con il piombo, il cromo e il cobalto.


Risultati principali task 7 1 1 unisalento biotecgen

Risultati Principali – Task 7.1.1 (UNISALENTO, Biotecgen)

  • Attività 7.1.1.c - Funzionalizzazione di cristalli di quarzo con specifici ligandi per l’analisi degli ioni metallici con microbilance piezoelettriche

  • Le attività hanno riguardato lo studio e l’individuazione dei materiali, della tipologia di deposizione e dello spessore degli strati attivi scelti. Questi sono stati impiegati come sensori piezoelettrici mostrando risultati promettenti per la messa a punto definitiva.

  • Sono state condotte prove sperimentali per la definizione della tipologia di deposizione su quarzo piezoelettrico e dello spessore dello strato attivo in grado di garantire le migliori prestazioni nell’analisi di metalli pesanti in mezzo acquoso.

  • È stato possibile dimostrare che ligandi tiofenici mostrano buone potenzialità per il sensing del piombo e del cadmio.

Struttura chimica del polimero tiofenico

utilizzato nel sensore.


S i mi s a

OR 7 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Metalli Pesanti e Microrganismi Patogeni in Prodotti Freschi

OS 7.3: Sviluppo di sistemi di allerta rapidi per la presenza di Listeria e Salmonella in tagli bovini prima della destinazione d’uso

Partner:

  • ISPA-CNR Lecce

  • Biotecgensrl

  • Industria Ciullo Carni srl

    Soggetto attuatore:

  • D.A.Re. scrl


Avanzamento os 7 3

Avanzamento OS 7.3


Stato di avanzamento delle attivit al 30 04 201311

Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)

  • Task 7.3.1: Analisibioinformatica e progettazione e sperimentazione di DNA arrays (M1-18)

    • stato: in corso (100% completato)

  • Task 7.3.2: Analisisumatricecomplessa (M1-22)

    • stato: in corso (65% completato)

  • Task 7.3.3: Messa a punto di sistemi di rilevamentodeipatogenitramite protein chip biosensori, DNA microarrays, e immunosensori lateral flow (M4-28)

    • stato: in corso (40% completato)


Risultati principali2

Risultati Principali

  • Messa a punto del protocollo per il Lateral Flow ImmunoAssay

  • Messa a punto del protocollo per i protein chip Immunoassay


Lateral flow immuno assays risultati

Lateral Flow ImmunoAssays: risultati

Scelta della membrana

HF240 HF 180

Alta Porosità ottima mobilità

Lateral Flow Assay: complessi batteri-anticorpi-goldQD migrano per capillarità fino a incontrare l’anticorpo fissato alla membrana

Risultati preliminari mostrano l’attuale limite di detection del metodo è di 10.000 UFC/ml di Salmonella


S i mi s a

Protein Chip Assays

L L L L

A B C

Diluizioni scalari

Ab control

Ab control

Protein-chips per Listeria

1a, 1b: Campioni di Listeria catturati, rilevati in fluorescenza blu

Limite di detection: 1000 UFC/ml

Protein-chips per Salmonelle: risultati di ibridazione

A: con anticorpi fluorescenti (anti-Salmonelle)

B: colorante lipidico fluorescente,

C: marcatore di membrana fluorescente


S i mi s a

OR 8 – Scale Up Industriale degli Strumenti Preventivi, di Controllo e Correttivi Messi a Punto nel Progetto


Avanzamento os 8 1 8 2 8 3

Avanzamento OS 8.1 – 8.2 – 8.3


Rendicontato progetto di ricerca

% Rendicontato Progetto di Ricerca


Rendicontazione ricerca industriale

Rendicontazione Ricerca Industriale


Rendicontazione sviluppo sperimentale

Rendicontazione Sviluppo Sperimentale


Rendicontazione totale progetto di ricerca

Rendicontazione Totale Progetto di Ricerca


Soggetti partner coinvolti nei sal i ii iii

Soggetti Partner coinvolti nei SAL I-II-III

  • Entidi Ricerca

  • ISPA CNR

  • IBBE CNR

  • Università degli Studi di Foggia:

  • - Dipartimento SAFE

  • Università degli Studi di Bari:

  • - Dipartimento di Medicina Veterinaria

  • - Dipartimento DISSPA

  • Università del Salento:

  • - Dipartimento DiSTeBA

  • Aziende

  • BonassisaLabsrl

  • Lab.Instrumentssrl

  • Industrie Fracchiolla srl

  • Molini Tandoi spa

  • Biotecgensrl


Avanzamento rendicontazione per partner sal i ii iii

% Avanzamento Rendicontazione per Partner SAL I – II - III


Conclusioni

Conclusioni

  • I risultati scientifici fino ad ora conseguiti confermano la possibilità di perseguire gli obiettivi di ricerca ambiti in fase di progettazione iniziale.

  • Le difficoltà nell’espletamento di alcune attività progettuali sono dovute all’impossibilità, da parte di Amministrazioni di alcuni Partner, di effettuare anticipazioni.

    Per il buon esito del progetto si rendono, pertanto, necessarie:

  • Proroga

  • Rimodulazione dei costi e di alcune attività progettuali a causa di criticità emerse soprattutto alla luce della rinuncia, da parte di 3 aziende partner, alla partecipazione al progetto.


S i mi s a

S.I.Mi.S.A.

Proposta di rimodulazione progetto di ricerca


Proposta di rimodulazione

Proposta di Rimodulazione

Principali modifiche richieste:

  • Proroga al 30/06/2013 e aggiornamento GANTT

  • Riduzione/Azzeramento della voce di costo «Strumenti e Attrezzature» per taluni partner e ridistribuzione del budget tra le altre voci di costo

  • Rinuncia alla partecipazione di progetto da parte dell’azienda Centro Latte Stasi srle sostituzione con l’azienda Sanguedolcesrl

  • Rinuncia alla partecipazione di progetto da parte di Azienda Viti-vinicola Incoronata e Coop. Lavorazione Prodotti Agricoli e ri-attribuzione dei relativi budget a D.A.Re.

  • Sostituzione del task 2.1.2 relativo alla messa a punto di biosensori per la determinazione simultanea di glucosio ed alcol nelle uve con un task di maggiore coerenza con l’obiettivo generale del progetto SIMISA. Tale task riguarderà lo sviluppo e validazione di una metodica analitica ICP-OES per la determinazione simultanea di potassio e metalli pesanti nelle uve e vino.


S i mi s a

S.I.Mi.S.A.

Proposta di rimodulazione progetto formazione


Razionali della rimodulazione

RAZIONALI DELLA RIMODULAZIONE

  • La rimodulazione che si intende proporre rispetto al capitolato approvato deriva dall’esigenza di adeguare gli obiettivi inizialmente previsti rispetto alla nuova pianificazione temporale e ai vincoli formali conseguenti all’attivazione dei percorsi formativi.

  • L’obiettivo formativo A (ricercatori) non prevede più che i destinatari siano inseriti in un programma di Dottorato di Ricerca, non essendoci le condizioni amministrative e regolamentari per l’inclusione di dottorati nei programmi universitari in corso nel periodo del progetto, ma che siano laureati selezionati in base procedure di evidenza pubblica, dove il titolo di Dottore di Ricerca verrà valutato con un punteggio aggiuntivo nella griglia di valutazione dei titoli prevista dalla procedura selettiva stessa;

  • Sia l’obiettivo A che l’obiettivo B (tecnici) saranno esplicati mediante due corsi di formazione, senza titolo legale, banditi dal CNR in partenariato con i partner di progetto.


Razionali della rimodulazione1

RAZIONALI DELLA RIMODULAZIONE

  • E’ stato ridotto il numero di ore di didattica passando da 2.884 ore della proposta iniziale approvata a 1888 ore dell’attuale. Tale riduzione è dovuta alla sopravvenuta esigenza di non effettuare due edizioni del corso dell’obiettivo A. Si prevede infatti di realizzare solo una edizione di tale percorso didattico, non essendo possibile rispettare la tempistica inizialmente prevista, a causa dell’allungamento dei tempi di finanziamento del progetto e della conclusione delle procedure burocratiche di avvio dello stesso

  • Il numero dei formandi è rimasto invariato per entrambi i corsi (10 per corso)

  • Il valore della borsa di studio nell’obiettivo A è stato diminuito in modo tale da veicolare le risorse ottenute all’aumento del valore della borsa nell’obiettivo B

  • È stato innalzato il limite di età per i formandi portandolo ai 32 anni o 35 anni se in possesso di dottorato di ricerca

  • A causa dei ritardi dovuti all’iter di approvazione del progetto stesso si rende necessaria una proroga con slittamento della scadenza del progetto a giugno 2015


Razionali della rimodulazione2

RAZIONALI DELLA RIMODULAZIONE

  • Si è previsto l’ingresso di due partner del progetto di ricerca (Bonassisa e Labinstruments) anche nel progetto di formazione per le attività del modulo B-affiancamento on the job con spostamento di risorse dal partner CNR-ISPA

  • Per adeguamento alle sopravvenute esigenze organizzative, sono state attribuite ore di docenza al partner UNIFG sia nell’ambito dell’obiettivo A che nell’ambito dell’obiettivo B

  • Il costo complessivo del progetto è stato mantenuto come da decreto.

  • I costi totali dei partner UNIFG e D.A.Re sono rimasti invariati, mentre il costo totale del partner CNR-ISPA è diminuito per l’attribuzione di risorse ai nuovi partner di progetto.

  • In tutti i partner presenti da capitolato tecnico approvato, si sono apportate variazioni alle interno delle singole voci di costo, in alcuni casi anche attivando nuove voci di costo, a causa di una più efficiente allocazione delle risorse rispetto alle attuali necessità e durata delle attività.


Rimodulazione finanziaria

RIMODULAZIONE FINANZIARIA


S i mi s a

S.I.Mi.S.A.

Grazie per l’attenzione!

Stato avanzamento lavori SAL I – II - III


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