СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 33

СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК PowerPoint PPT Presentation


  • 88 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК. Невяна Иванова, доктор Румяна Додова, магистър Даниела Дачева, магистър Център по Молекулна Медицина Медицински Университет - София. СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК. Секвениране генома на РНК-съдържащия бактериофаг MS2 ( Fiers et al 1976 )

Download Presentation

СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


1092206

СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК

Невяна Иванова, доктор

РумянаДодова, магистър

Даниела Дачева, магистър

Център по Молекулна Медицина

Медицински Университет - София


1092206

СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК

  • Секвениране генома на РНК-съдържащия бактериофаг MS2 (Fiers et al 1976)

  • Секвениранегеноманафага Х174 (~5kb) поплюс/минусметода (Snager&Coulson, 1977)

  • Първи метод за секвениране на ДНК: Секвениране чрез „химично накъсване“, ~500 нтд (Maxam & Gilbert, 1977)

  • Секвениране чрез „верижно терминиране на синтеза на ДНК“, (Sanger et al, 1977)

Oпределяне последователността на свързване на четирите основни нуклеотидни базиG,А,C,Т,в първичната структура на ДНК.


1092206

  • Thermal cycle sequencing

  • Автоматично секвениране- Верижно терминиране с флуоресцентно-белязани дидезоксинуклеотиди (Dye-terminator sequencing);

  • - Капилярна електрофореза;

  • - Лазерна детекция на сигнала.

HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING

  • Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS)

  • Polony sequencing (eмулсионен PCR)

  • Pyrosequencing

  • Solexa sequencing (bridge PCR, reversible dye terminator)

  • Sequencing by ligation (SOLiD)

  • Ion-semiconductor sequencing

  • Nanoball sequencing

  • Single-molecular sequencing (Helioscope)

  • Single-molecule Real-Time sequencing

  • Nanopore

  • VisiGen (FRET, полимераза с флуоресцентен донор в АЦ)

  • Секвениране чрез хибридизация (Microarray)


Xam gilbert

  • НЕДОСТАТЪЦИ:

  • Изисква голямо количество ДНК

  • Токсичност на реактивите

  • Невъзможна автоматизация

  • Къси секвенции

  • Затруднено отчитане

  • ПРИЛОЖЕНИЕ:

  • ДНК-Белтъчни взаимодействия

  • Вторична структура на ДНК

  • Локализиране на редки бази

  • Епигенетични модификации

CH3

Метод на Маxam-Gilbert

  • Allan Maxam & Walter Gilbert, 1977г.

  • Gilbert, Sanger, Berg,Нобелова награда, 1980, за:

Д“принос към определянето на базовите секвенции в НК”Директно секвениране, чрез химично модифициране на базите в ДНК-молекулата и последващо базово-специфично накъсване, без да е необходимо предварително клониране


Sanger

Секвениране по Sanger

Frederick Sanger, 1974, Нобелова награда, 1980

Секвениране чрез случайно терминиране на синтеза, с радиоактивно-белязани ддНТФи

  • ДНК, Праймер, Буфер, дНТФ

  • ддНТФ

  • 5´- белязване с 32Р

  • Т7 ДНК-полимераза, topt (37°С)

  • четири отделни реакции

  • всеки етап - в отделен термоблок


1092206

THERMAL CYCLE SEQUENCING

( Sears et al., 1992)

  • Откриване на термостабилна ДНК-полимеразаи PCR

  • Методът използва dsDNA и много по-малко количество матрица (не е необходимо предварително клониране на фрагмента).

  • Процесът е като PCR, но само с един праймер и всяка реакционна смес съдържа по един терминиращ ddNTP. За разлика от PCR, нарастването на продукта е линейно, а не експоненциално, тъй като се копира само едната верига.

Както при класическия метод на Sanger, наличието на ddNTP в реакционната смес води до верижно терминиране.

Получените вериги с различна дължина, се разделят електрофоретично и могат да се прочетат.


1092206

АВТОМАТИЧНО СЕКВЕНИРАНЕ

(Leroy Hood and colleagues,1986)

Метод за секвениране на ДНК, при който радиоактивно-белязаните нуклеотиди и директното прочитане, са заменени с флуоресцентно белязване, лазерно-индуцирана детекция на сигнала и компютъризирано четене на секвенцията.

Използвани са флуоресцентно-белязани праймери. Приготвят се 4 отделни реакции – по една за всеки ддНТФ, във всяка, от които праймерът е белязан с различен флуорохром.

Флуоресцентното белязване прави възможно автоматичното прочитане на секвенцията с помощта на компютърна програма.

Въвеждането на автоматичното секвениране с флуоресцентно-белязани ддНТФ направи възможно постигането на висока ефективност при секвениране.


1092206

АВТОМАТИЧНО СЕКВЕНИРАНЕ

Секвениране сфлуоресцентно-

белязани праймери

Секвениране с

флуоресцентно-белязани ддНТФ

  • ПРЕДИМСТВА

  • без “labeling step”

  • Thermal cycle – sequencing

  • PCR - апарат

  • Надежден, лесноизпълним и ефективен протокол

  • Високата температура намалява вторичните структури, висока специфичност при праймиране, анилинг, удължаване

  • Един протокол за секвениране на ss и dsDNA

  • Възможност за секвениране на “трудни матрици” (BAC)


1092206

АВТОМАТИЧНО СЕКВЕНИРАНЕ С ФЛУОРЕСЦЕНТНО-БЕЛЯЗАНИ ддНТФи

Р1. Реакциите за четирите ддНТФ се извършват в една епруветка, като всеки ддНТФ е белязан с различен флуорофор.

П2. При придвижването си в гела, всеки фрагмент преминава през детектор, който идентифицира терминиращия ддНТФ, присъстващ всъответния фрагмент по сигнала от флуорофора.

И3. Информацията от сигнала се преобразува и визуализира като серия от пикове с различен цвят GATCи позиция.

Смес от флуоресцентно-белязани ддНТФи

Система за визуализация

Детектор

Флуоресцентно-белязаните фрагменти преминават през детектора по нарастване на молекулната маса


Rhodamine dyeterminators

ВЕРИЖНО ТЕРМИНИРАНЕ С ФЛУОРЕСЦЕНТНО-БЕЛЯЗАНИ ддНТФи

Rhodamine DyeTerminators

Rhodamine

Fluorescein

DNA-Rhodamine-Fluorescein


3130 l

АВТОМАТИЧЕН СЕКВЕНАТОР АВІ3130хl


1092206

СИСТЕМЕН ХОДНАСЕКВЕНИРАНЕ

  • ИЗБОР НА СТРАТЕГИЯ

  • Дължина на матрицата

  • Хомогенност на пробата

  • Брой проби

  • Информация за региона


De novo

СеквениранеDe novo

  • МЕТОДИ

  • Shot-gun

  • Primer walking

  • Случайно праймиране с транспозони

  • Nested - делеции

  • Секвениране на мРНК

  • PCR-амплификация


Resequencing

RESEQUENCING

  • PCR – праймери

  • Праймери с “опашка” за секвениране

  • Nested(вътрешен) праймери

ЕПИГЕНЕТИКА

След третиране с натриев бисулфит

MLST (Multi Locus Sequence Typing)


1092206

  • СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧНО ОПРЕДЕЛЯНЕ

  • Измерване на УВ-абсорбциятаПурини и пиримидини – 260 nm

    • CssDNA= A260 x 33 μg/μl

    • CdsDNA= A260 x 50 μg/μl

АГАРОЗНА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА

Mass Ladder

Смес от молекулни маркерис известна дължина (кб) и тегло (ng)

ОЦЕНКА НА ИЗОЛИРАНАТА ДНК

Капилярна електрофореза

Анализ на данните

Секвенционна реакция

Изолиране на НК

PCR

Пречистване

Преутаяване

  • Чистота на ДНК

  • А260/A280: 1.7 - 2.0

    • < 1.7 остатъчни белтък/фенол

    • > 2.0 остатъчна РНК

  • А230/A260: 0.3 – 0.9

    • > 0.9 остатъчни захари


1092206

ОЦЕНКА НА ИЗОЛИРАНАТА НК

  • ABSOLUTE QUANTITATION

  • Измерва общото количество на амплифициращата се ДНК

  • Изисква изготвяне на стандартна крива с помощта на геномна ДНК с известна концентрация, предварително измерена спектрофотометрично

    • TaqMan® анализ – изключително точно измерване

    • SYBR®Green анализ (MGB) – по-ниско специфичен

    • Багрилото се свързва с всяка dsDNA

ФЛУОРИМЕТРИЧЕН АНАЛИЗ

Интеркалиращи бои

Hoechst #33258Нисък афинитет към РНК

свързва се преференциално към АТ-участъци

Етидиев бромид Свързва РНК, състава на ДНК не е от значение

Детектира много ниски количества ДНК

Висока чистота при ДНК с високо GC-съдържание

PicoGreenДетектира количества < 25 pg/ml, до 100 ng/ml


1092206

ДИЗАЙН НА PCR-ПРАЙМЕРИ

Стандартен PCR

Бисулфит-специфичен PCR

  • 18 – 24 олигонуклеотид18-мер за GC-богати участъци

  • 50°C < Тm < 65°C Tm = (A+T) x 2°C + (G+C) x 4°C

  • Eквимоларно съдържание на нтд бази: (A+T) / (G+C) - до 60/40

  • отсъствие на комплементарни участъци(праймер-димери)

  • отсъствие на вторични структури (hairpin formation)

  • отсъствие на вторично-свързващи места

  • дължина > 30 нуклеотида

  • Tm ~ 60°C

  • да се избягват СрG в праймераТА-богати праймери

  • формиране на праймер – димериКонцентрация < 3 pmol

  • mismatch hybridization ↗ Тm

- добавяне на 5´-край за секвениране с универсални праймери21М13 (Forward)5´TGTAAAACGACGGCCAGT3´

M13rev (Reverse)5´CAGGAAACAGCTATGACC3´


1092206

PCR ЗА СЕКВЕНИРАНЕВисока специфичност и чувствителност

Капилярна електрофореза

Анализ на данните

Изолиране на НК

Секвенционна реакция

PCR

Пречистване

Преутаяване

Оптимизиран master-mix

  • дизайн на праймери

  • концентрация на MgCl2

  • концентрация на dNTP

  • праймерна концентрация

  • концентрация на ДНК

  • параметри на PCR

  • ензим Taq-полимераза„hot-start“- метод


1092206

PCR - СИСТЕМИ

  • Секвенции ~ 600 н.дв., 40 мин. – Бърза амплификация

  • Амплификация на тандемно-повторени последователности

  • Taq-полимераза с proofreading-активност (< 10 kб)

  • - за амплификация на микросателитни маркери

  • Амплификация на GC-богати участъци

  • Hot-start– полимераза за ДНК-участъци, съдържащи GC> 65%;

  • Саксесорни протеини за повишаване на специфичността.

  • Секвениране на дълги участъци (long range)

  • < 15 kб - Hot-start+ Proofreading (запазена 3’-5’екзонуклеазна активност), висока точност при клониране и мутагенеза

  • < 20 kб Антитяло медииран Hot-start+ аксесорни протеини за повишаване на специфичносттта;


1092206

КОЛИЧЕСТВО И КАЧЕСТВО НАДНК-МАТРИЦАТА ЗА СЕКВЕНИРАНЕ

Капилярна електрофореза

Анализ на данните

Секвенционна реакция

Изолиране на НК

PCR

Пречистване

Преутаяване

n (брой бази в таргетната секвенция)

50

Количество ДНК-матрица (ng)

=

  • Наличие на протеини, детергенти, геномна ДНК

    • Намаляват живота на капилярата

    • Късен старт на секвенцията

  • Непречистена матрица или наличие на множество матрици

    • Дължината на четене намалява

    • Намаляват живота на капилярата

    • Лошо качество на данните

  • Наличие на соли и ЕДТА-съдържащи буфери

    • Инжектират се преференциално

    • Инхибират ДНК-полимеразната активност

    • Лошо качество на данните


  • 1092206

    ПРЕЧИСТВАНЕ НА PCR-ПРОДУКТАПремахване на остатъка от реакционните компоненти

    Колонен

    Ензимен

    Гел-екстракция

    Разреждане

    МЕТОДИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ

    Eкзонуклеаза I (ЕхоI)- разгражда едноверижна ДНК (праймери)

    Алкална фосфатаза (SAP/CIP) -дефосфорилира дНТФ

    • гел-филтрация

    • ултрафилтрация

    PCR-продукт/ дест. вода

    (1/5 или 1/10)


    1092206

    ИЗБОР НА МЕТОД ЗА ПРЕЧИСТВАНЕЗависи от качеството на PCR-продукта


    1092206

    ИЗБОР НА СЕКВЕНЦИОННИ ПРАЙМЕРИ


    T h ermal cycle sequencing

    THERMAL CYCLE SEQUENCING

    Капилярна електрофореза

    Анализ на данните

    Секвенционна реакция

    Изолиране на НК

    PCR

    Пречистване

    Преутаяване

    • ДНК-матрица

    • Праймер

    • BigDye®Terminator

    • Буфер

    • AmpliTaq®DNAPol FS

    • ниска дискриминация между дНТФ и ддНТФ;

    • почти липсваща 5´-3´-eкзонуклеазна активност;

    • комбиниран с термостабилна неорганична пирофосфатаза.


    Bigdye terminator sequence kits

    BigDye®Terminator Sequence Kits


    Gt bigdye terminator v3 1 1 1

    Секвениране на GT-богат районс BigDye®Terminatorv3.1/1.1

    Секвениране на GT-богат районс dGTPBigDye®Terminatorv1.0/3.0

    Секвениране на 2 хомополимерни Т-участъка сdRhodamine®Terminator


    1092206

    МЕТОДИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ НА СЕКВЕНЦИОННИЯ ПРОДУКТ

    Мембранно филтриране

    Гел-филтрация

    BigDye®XTerminator

    Магнитни частици

    Етанолна преципитация

    ПРЕЧИСТВАНЕ НА СЕКВЕНЦИОННИЯ ПРОДУКТ

    Капилярна електрофореза

    Анализ на данните

    Секвенционна реакция

    Изолиране на НК

    Остатъчните небелязани и флуоресцентно – белязани компоненти на реакцията възпрепятстват електрокинетичното инжектиране на пробата, електрофоретичното разделяне и анализа на данни.

    PCR

    Пречистване

    Преутаяване

    „dye blobs“


    1092206

    EDTA/CH3OONa/ЕТАНОЛНА ПРЕЦИПИТАЦИЯ

    • Преутаяване на секвенционния продукт с абсолютен етанол

    • EDTA – стабилизира секвенционния

    • Натриев ацетат – запазва късите секвенционни продукти

    • Лесен и евтин

    • Възпроизводим

    • Работа с всички формати

    • Относително дълга процедура

    • Центрофуга с носачи за плаки

    • Риск от загуба на утайката

    Провежда се при стайна температура

    Абсолютен етанол – 96%

    Използва се прясно приготвен етанол

    3 М Натриев ацетат (pH 4.8)

    Отстраняване на етанолните остатъци след последното центрофугиране


    1092206

    Смес от LMW и HMW - молекули

    ГЕЛ-ФИЛТРАЦИЯ

    Филтрираща смола

    • Колона Sephadex G-50

    • пореста смола „молекулно сито“

    • секвенционната реакция се нанася в центъра на колоната

    • „задържа“ LMW-молекули и пропуска HMW-молекули

    LMW се абсорбират и елуират последни

    HMW преминават свободно и се елуират първи

    • Лесен

    • Възпроизводим

    • Подлежи на автоматизация

    • Относително скъп

    • Допълнителна обработка с

    • SDS и нагряване (BDТv3.1)

    УЛТРАФИЛТРАЦИЯ

    Отстраняване на замърсяванията чрез филтриране на секвенционния продукт през финна мембрана с размер на порите 0.1 – 10 μm


    1092206

    ПРЕЧИСТВАНЕ С МАГНИТНИ ЧАСТИЦИ

    Магнитно разделяне и отстраняване на надутайката

    Ресуспендирани магнитни частици

    1. Отмиване

    2. Елуиране на таргета с ниско-солеви буфери или дестилирана вода

    3. Отстраняване на магнитните частици в магнитно поле

    Свързване на лиганда с магнитните частици

    • Лесен и ефективен

    • Високо специфичен

    • Възможност за роботизация

    • Относително скъп

    • Изисква биотинилиран праймер

    • Изисква специална апаратура

    • Афинитетна хроматография с магнитно разделяне

    • магнитни частици, с имобилизиран лиганд (целулоза, оligo (dT), стрептавидин и др.), с афинитет към НК

    • лигандът свързва секвенционният продукт, а дНТФи, праймери и соли остават в разтвора

    Добавяне на смес с таргетната молекула

    Лиганд

    Афинитетно свързване


    1092206

    ПРЕЧИСТЕН СЕКВЕНЦИОНЕН ПРОДУКТ

    ЕЛЕКТРОКИНЕТИЧНА ИНЖЕКЦИЯ

    Не е необходима топлинна денатурация преди инжектирането

    ПОДГОТОВКА НА ПРОБАТА ЗА ИНЖЕКТИРАНЕ

    Капилярна електрофореза

    Анализ на данните

    Секвенционна реакция

    Изолиране на НК

    PCR

    Пречистване

    Преутаяване

    УТАЙКА

    ЕЛУАТ/ФИЛТРАТ

    BigDye®XTerminator™

    Ресуспендиране в HI-DI™формамид


    1092206

    ПОДГОТОВКА НА ИНСТРУМЕНТАКОНСУМАТИВИ ABI3730xlСеквенционни стандартиПолимер РОР™КапиляриБуфер за електрофорезаКАЛИБРАЦИЯ НА ИНСТРУМЕНТАПространственаСпектралнаData Collection softwareСЪЗДАВАНЕ НА ФАЙЛ С ВХОДЯЩИТЕ ПРОБИДЕФИНИРАНЕ НА ГРУПИС РЕЗУЛТАТИИЗБОР НА ПРОТОКОЛInstrument protocolAnalysis protocolПОСТАВЯНЕ НА ПРОБИТЕ В АПАРАТАСТАРТИРАНЕ НА ИНСТРУМЕНТА


    1092206

    АНАЛИЗ НА ДАННИТЕ

    Капилярна електрофореза

    Анализ на данните

    Секвенционна реакция

    Изолиране на НК

    PCR

    Пречистване

    Преутаяване


  • Login