slide1
Download
Skip this Video
Download Presentation
СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 33

, , , - - PowerPoint PPT Presentation


  • 146 Views
  • Uploaded on

СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК. Невяна Иванова, доктор Румяна Додова, магистър Даниела Дачева, магистър Център по Молекулна Медицина Медицински Университет - София. СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК. Секвениране генома на РНК-съдържащия бактериофаг MS2 ( Fiers et al 1976 )

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' , , , - ' - ganesa


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК

Невяна Иванова, доктор

РумянаДодова, магистър

Даниела Дачева, магистър

Център по Молекулна Медицина

Медицински Университет - София

slide2

СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК

  • Секвениране генома на РНК-съдържащия бактериофаг MS2 (Fiers et al 1976)
  • Секвениранегеноманафага Х174 (~5kb) поплюс/минусметода (Snager&Coulson, 1977)
  • Първи метод за секвениране на ДНК: Секвениране чрез „химично накъсване“, ~500 нтд (Maxam & Gilbert, 1977)
  • Секвениране чрез „верижно терминиране на синтеза на ДНК“, (Sanger et al, 1977)

Oпределяне последователността на свързване на четирите основни нуклеотидни базиG,А,C,Т,в първичната структура на ДНК.

slide3

Thermal cycle sequencing

  • Автоматично секвениране - Верижно терминиране с флуоресцентно-белязани дидезоксинуклеотиди (Dye-terminator sequencing);
  • - Капилярна електрофореза;
  • - Лазерна детекция на сигнала.

HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING

  • Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS)
  • Polony sequencing (eмулсионен PCR)
  • Pyrosequencing
  • Solexa sequencing (bridge PCR, reversible dye terminator)
  • Sequencing by ligation (SOLiD)
  • Ion-semiconductor sequencing
  • Nanoball sequencing
  • Single-molecular sequencing (Helioscope)
  • Single-molecule Real-Time sequencing
  • Nanopore
  • VisiGen (FRET, полимераза с флуоресцентен донор в АЦ)
  • Секвениране чрез хибридизация (Microarray)
xam gilbert

НЕДОСТАТЪЦИ:

  • Изисква голямо количество ДНК
  • Токсичност на реактивите
  • Невъзможна автоматизация
  • Къси секвенции
  • Затруднено отчитане
  • ПРИЛОЖЕНИЕ:
  • ДНК-Белтъчни взаимодействия
  • Вторична структура на ДНК
  • Локализиране на редки бази
  • Епигенетични модификации

CH3

Метод на Маxam-Gilbert
  • Allan Maxam & Walter Gilbert, 1977г.
  • Gilbert, Sanger, Berg,Нобелова награда, 1980, за:

Д“принос към определянето на базовите секвенции в НК”Директно секвениране, чрез химично модифициране на базите в ДНК-молекулата и последващо базово-специфично накъсване, без да е необходимо предварително клониране

sanger
Секвениране по Sanger

Frederick Sanger, 1974, Нобелова награда, 1980

Секвениране чрез случайно терминиране на синтеза, с радиоактивно-белязани ддНТФи

  • ДНК, Праймер, Буфер, дНТФ
  • ддНТФ
  • 5´- белязване с 32Р
  • Т7 ДНК-полимераза, topt (37°С)
  • четири отделни реакции
  • всеки етап - в отделен термоблок
slide6

THERMAL CYCLE SEQUENCING

( Sears et al., 1992)

  • Откриване на термостабилна ДНК-полимеразаи PCR
  • Методът използва dsDNA и много по-малко количество матрица (не е необходимо предварително клониране на фрагмента).
  • Процесът е като PCR, но само с един праймер и всяка реакционна смес съдържа по един терминиращ ddNTP. За разлика от PCR, нарастването на продукта е линейно, а не експоненциално, тъй като се копира само едната верига.

Както при класическия метод на Sanger, наличието на ddNTP в реакционната смес води до верижно терминиране.

Получените вериги с различна дължина, се разделят електрофоретично и могат да се прочетат.

slide7

АВТОМАТИЧНО СЕКВЕНИРАНЕ

(Leroy Hood and colleagues,1986)

Метод за секвениране на ДНК, при който радиоактивно-белязаните нуклеотиди и директното прочитане, са заменени с флуоресцентно белязване, лазерно-индуцирана детекция на сигнала и компютъризирано четене на секвенцията.

Използвани са флуоресцентно-белязани праймери. Приготвят се 4 отделни реакции – по една за всеки ддНТФ, във всяка, от които праймерът е белязан с различен флуорохром.

Флуоресцентното белязване прави възможно автоматичното прочитане на секвенцията с помощта на компютърна програма.

Въвеждането на автоматичното секвениране с флуоресцентно-белязани ддНТФ направи възможно постигането на висока ефективност при секвениране.

slide8
АВТОМАТИЧНО СЕКВЕНИРАНЕ

Секвениране сфлуоресцентно-

белязани праймери

Секвениране с

флуоресцентно-белязани ддНТФ

  • ПРЕДИМСТВА
  • без “labeling step”
  • Thermal cycle – sequencing
  • PCR - апарат
  • Надежден, лесноизпълним и ефективен протокол
  • Високата температура намалява вторичните структури, висока специфичност при праймиране, анилинг, удължаване
  • Един протокол за секвениране на ss и dsDNA
  • Възможност за секвениране на “трудни матрици” (BAC)
slide9

АВТОМАТИЧНО СЕКВЕНИРАНЕ С ФЛУОРЕСЦЕНТНО-БЕЛЯЗАНИ ддНТФи

Р1. Реакциите за четирите ддНТФ се извършват в една епруветка, като всеки ддНТФ е белязан с различен флуорофор.

П2. При придвижването си в гела, всеки фрагмент преминава през детектор, който идентифицира терминиращия ддНТФ, присъстващ всъответния фрагмент по сигнала от флуорофора.

И3. Информацията от сигнала се преобразува и визуализира като серия от пикове с различен цвят GATCи позиция.

Смес от флуоресцентно-белязани ддНТФи

Система за визуализация

Детектор

Флуоресцентно-белязаните фрагменти преминават през детектора по нарастване на молекулната маса

rhodamine dyeterminators

ВЕРИЖНО ТЕРМИНИРАНЕ С ФЛУОРЕСЦЕНТНО-БЕЛЯЗАНИ ддНТФи

Rhodamine DyeTerminators

Rhodamine

Fluorescein

DNA-Rhodamine-Fluorescein

slide12
СИСТЕМЕН ХОДНАСЕКВЕНИРАНЕ
  • ИЗБОР НА СТРАТЕГИЯ
  • Дължина на матрицата
  • Хомогенност на пробата
  • Брой проби
  • Информация за региона
de novo
СеквениранеDe novo
  • МЕТОДИ
  • Shot-gun
  • Primer walking
  • Случайно праймиране с транспозони
  • Nested - делеции
  • Секвениране на мРНК
  • PCR-амплификация
resequencing
RESEQUENCING
  • PCR – праймери
  • Праймери с “опашка” за секвениране
  • Nested(вътрешен) праймери

ЕПИГЕНЕТИКА

След третиране с натриев бисулфит

MLST (Multi Locus Sequence Typing)

slide15

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧНО ОПРЕДЕЛЯНЕ

  • Измерване на УВ-абсорбциятаПурини и пиримидини – 260 nm
      • CssDNA= A260 x 33 μg/μl
      • CdsDNA= A260 x 50 μg/μl

АГАРОЗНА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА

Mass Ladder

Смес от молекулни маркерис известна дължина (кб) и тегло (ng)

ОЦЕНКА НА ИЗОЛИРАНАТА ДНК

Капилярна електрофореза

Анализ на данните

Секвенционна реакция

Изолиране на НК

PCR

Пречистване

Преутаяване

  • Чистота на ДНК
  • А260/A280: 1.7 - 2.0
    • < 1.7 остатъчни белтък/фенол
    • > 2.0 остатъчна РНК
  • А230/A260: 0.3 – 0.9
    • > 0.9 остатъчни захари
slide16
ОЦЕНКА НА ИЗОЛИРАНАТА НК
  • ABSOLUTE QUANTITATION
  • Измерва общото количество на амплифициращата се ДНК
  • Изисква изготвяне на стандартна крива с помощта на геномна ДНК с известна концентрация, предварително измерена спектрофотометрично
    • TaqMan® анализ – изключително точно измерване
    • SYBR®Green анализ (MGB) – по-ниско специфичен
    • Багрилото се свързва с всяка dsDNA

ФЛУОРИМЕТРИЧЕН АНАЛИЗ

Интеркалиращи бои

Hoechst #33258Нисък афинитет към РНК

свързва се преференциално към АТ-участъци

Етидиев бромид Свързва РНК, състава на ДНК не е от значение

Детектира много ниски количества ДНК

Висока чистота при ДНК с високо GC-съдържание

PicoGreenДетектира количества < 25 pg/ml, до 100 ng/ml

slide17
ДИЗАЙН НА PCR-ПРАЙМЕРИ

Стандартен PCR

Бисулфит-специфичен PCR

  • 18 – 24 олигонуклеотид18-мер за GC-богати участъци
  • 50°C < Тm < 65°C Tm = (A+T) x 2°C + (G+C) x 4°C
  • Eквимоларно съдържание на нтд бази: (A+T) / (G+C) - до 60/40
  • отсъствие на комплементарни участъци(праймер-димери)
  • отсъствие на вторични структури (hairpin formation)
  • отсъствие на вторично-свързващи места
  • дължина > 30 нуклеотида
  • Tm ~ 60°C
  • да се избягват СрG в праймераТА-богати праймери
  • формиране на праймер – димериКонцентрация < 3 pmol
  • mismatch hybridization ↗ Тm

- добавяне на 5´-край за секвениране с универсални праймери 21М13 (Forward) 5´TGTAAAACGACGGCCAGT3´

M13rev (Reverse) 5´CAGGAAACAGCTATGACC3´

slide18
PCR ЗА СЕКВЕНИРАНЕВисока специфичност и чувствителност

Капилярна електрофореза

Анализ на данните

Изолиране на НК

Секвенционна реакция

PCR

Пречистване

Преутаяване

Оптимизиран master-mix

  • дизайн на праймери
  • концентрация на MgCl2
  • концентрация на dNTP
  • праймерна концентрация
  • концентрация на ДНК
  • параметри на PCR
  • ензим Taq-полимераза„hot-start“- метод
slide19
PCR - СИСТЕМИ
  • Секвенции ~ 600 н.дв., 40 мин. – Бърза амплификация
  • Амплификация на тандемно-повторени последователности
  • Taq-полимераза с proofreading-активност (< 10 kб)
  • - за амплификация на микросателитни маркери
  • Амплификация на GC-богати участъци
  • Hot-start– полимераза за ДНК-участъци, съдържащи GC> 65%;
  • Саксесорни протеини за повишаване на специфичността.
  • Секвениране на дълги участъци (long range)
  • < 15 kб - Hot-start+ Proofreading (запазена 3’-5’екзонуклеазна активност), висока точност при клониране и мутагенеза
  • < 20 kб Антитяло медииран Hot-start+ аксесорни протеини за повишаване на специфичносттта;
slide20
КОЛИЧЕСТВО И КАЧЕСТВО НАДНК-МАТРИЦАТА ЗА СЕКВЕНИРАНЕ

Капилярна електрофореза

Анализ на данните

Секвенционна реакция

Изолиране на НК

PCR

Пречистване

Преутаяване

n (брой бази в таргетната секвенция)

50

Количество ДНК-матрица (ng)

=

  • Наличие на протеини, детергенти, геномна ДНК
      • Намаляват живота на капилярата
      • Късен старт на секвенцията
  • Непречистена матрица или наличие на множество матрици
      • Дължината на четене намалява
      • Намаляват живота на капилярата
      • Лошо качество на данните
  • Наличие на соли и ЕДТА-съдържащи буфери
      • Инжектират се преференциално
      • Инхибират ДНК-полимеразната активност
      • Лошо качество на данните
slide21
ПРЕЧИСТВАНЕ НА PCR-ПРОДУКТАПремахване на остатъка от реакционните компоненти

Колонен

Ензимен

Гел-екстракция

Разреждане

МЕТОДИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ

Eкзонуклеаза I (ЕхоI)- разгражда едноверижна ДНК (праймери)

Алкална фосфатаза (SAP/CIP) -дефосфорилира дНТФ

  • гел-филтрация
  • ултрафилтрация

PCR-продукт/ дест. вода

(1/5 или 1/10)

slide22
ИЗБОР НА МЕТОД ЗА ПРЕЧИСТВАНЕЗависи от качеството на PCR-продукта
t h ermal cycle sequencing
THERMAL CYCLE SEQUENCING

Капилярна електрофореза

Анализ на данните

Секвенционна реакция

Изолиране на НК

PCR

Пречистване

Преутаяване

  • ДНК-матрица
  • Праймер
  • BigDye®Terminator
  • Буфер
  • AmpliTaq®DNAPol FS
  • ниска дискриминация между дНТФ и ддНТФ;
  • почти липсваща 5´-3´-eкзонуклеазна активност;
  • комбиниран с термостабилна неорганична пирофосфатаза.
gt bigdye terminator v3 1 1 1
Секвениране на GT-богат районс BigDye®Terminatorv3.1/1.1

Секвениране на GT-богат районс dGTPBigDye®Terminatorv1.0/3.0

Секвениране на 2 хомополимерни Т-участъка сdRhodamine®Terminator

slide27

МЕТОДИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ НА СЕКВЕНЦИОННИЯ ПРОДУКТ

Мембранно филтриране

Гел-филтрация

BigDye®XTerminator

Магнитни частици

Етанолна преципитация

ПРЕЧИСТВАНЕ НА СЕКВЕНЦИОННИЯ ПРОДУКТ

Капилярна електрофореза

Анализ на данните

Секвенционна реакция

Изолиране на НК

Остатъчните небелязани и флуоресцентно – белязани компоненти на реакцията възпрепятстват електрокинетичното инжектиране на пробата, електрофоретичното разделяне и анализа на данни.

PCR

Пречистване

Преутаяване

„dye blobs“

slide28

EDTA/CH3OONa/ЕТАНОЛНА ПРЕЦИПИТАЦИЯ

  • Преутаяване на секвенционния продукт с абсолютен етанол
  • EDTA – стабилизира секвенционния
  • Натриев ацетат – запазва късите секвенционни продукти
  • Лесен и евтин
  • Възпроизводим
  • Работа с всички формати
  • Относително дълга процедура
  • Центрофуга с носачи за плаки
  • Риск от загуба на утайката

Провежда се при стайна температура

Абсолютен етанол – 96%

Използва се прясно приготвен етанол

3 М Натриев ацетат (pH 4.8)

Отстраняване на етанолните остатъци след последното центрофугиране

slide29

Смес от LMW и HMW - молекули

ГЕЛ-ФИЛТРАЦИЯ

Филтрираща смола

  • Колона Sephadex G-50
  • пореста смола „молекулно сито“
  • секвенционната реакция се нанася в центъра на колоната
  • „задържа“ LMW-молекули и пропуска HMW-молекули

LMW се абсорбират и елуират последни

HMW преминават свободно и се елуират първи

  • Лесен
  • Възпроизводим
  • Подлежи на автоматизация
  • Относително скъп
  • Допълнителна обработка с
  • SDS и нагряване (BDТv3.1)

УЛТРАФИЛТРАЦИЯ

Отстраняване на замърсяванията чрез филтриране на секвенционния продукт през финна мембрана с размер на порите 0.1 – 10 μm

slide30

ПРЕЧИСТВАНЕ С МАГНИТНИ ЧАСТИЦИ

Магнитно разделяне и отстраняване на надутайката

Ресуспендирани магнитни частици

1. Отмиване

2. Елуиране на таргета с ниско-солеви буфери или дестилирана вода

3. Отстраняване на магнитните частици в магнитно поле

Свързване на лиганда с магнитните частици

  • Лесен и ефективен
  • Високо специфичен
  • Възможност за роботизация
  • Относително скъп
  • Изисква биотинилиран праймер
  • Изисква специална апаратура
  • Афинитетна хроматография с магнитно разделяне
  • магнитни частици, с имобилизиран лиганд (целулоза, оligo (dT), стрептавидин и др.), с афинитет към НК
  • лигандът свързва секвенционният продукт, а дНТФи, праймери и соли остават в разтвора

Добавяне на смес с таргетната молекула

Лиганд

Афинитетно свързване

slide31

ПРЕЧИСТЕН СЕКВЕНЦИОНЕН ПРОДУКТ

ЕЛЕКТРОКИНЕТИЧНА ИНЖЕКЦИЯ

Не е необходима топлинна денатурация преди инжектирането

ПОДГОТОВКА НА ПРОБАТА ЗА ИНЖЕКТИРАНЕ

Капилярна електрофореза

Анализ на данните

Секвенционна реакция

Изолиране на НК

PCR

Пречистване

Преутаяване

УТАЙКА

ЕЛУАТ/ФИЛТРАТ

BigDye®XTerminator™

Ресуспендиране в HI-DI™формамид

slide32

ПОДГОТОВКА НА ИНСТРУМЕНТАКОНСУМАТИВИ ABI3730xlСеквенционни стандартиПолимер РОР™КапиляриБуфер за електрофорезаКАЛИБРАЦИЯ НА ИНСТРУМЕНТАПространственаСпектралнаData Collection softwareСЪЗДАВАНЕ НА ФАЙЛ С ВХОДЯЩИТЕ ПРОБИДЕФИНИРАНЕ НА ГРУПИС РЕЗУЛТАТИИЗБОР НА ПРОТОКОЛInstrument protocolAnalysis protocolПОСТАВЯНЕ НА ПРОБИТЕ В АПАРАТАСТАРТИРАНЕ НА ИНСТРУМЕНТА

slide33
АНАЛИЗ НА ДАННИТЕ

Капилярна електрофореза

Анализ на данните

Секвенционна реакция

Изолиране на НК

PCR

Пречистване

Преутаяване

ad