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Animali transgenici: concetti e applicazioni in biomedicina

Animali transgenici: concetti e applicazioni in biomedicina. MANIPOLARE IL GENOMA DEL TOPO:. Generazione di TOPI TRANSGENICI: microiniezione di DNA esogeno in uova fertilizzate. Il DNA si integra a posizioni CASUALI nel genoma.

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Animali transgenici: concetti e applicazioni in biomedicina

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Presentation Transcript

  1. Animali transgenici: concetti e applicazioni in biomedicina

  2. MANIPOLARE IL GENOMA DEL TOPO: • Generazione di TOPI TRANSGENICI: microiniezione di DNA esogeno in uova fertilizzate. Il DNA si integra a posizioni CASUALI nel genoma. • Generazione di mutazioni specifiche in geni endogeni: RICOMBINAZIONE OMOLOGA IN CELLULE ES (Embryonic Stem Cells). Il DNA si integra a siti di omologia con il vettore usato.

  3. P/E GENE PA Generazione di topi transgenici • Il gene da esprimere viene clonato sotto il controllo di regioni regolatrici adatte e purificato dal plasmide. • Le regioni regolatrici vengono scelte in base all’attivita’, la distribuzione tissutale e nello sviluppo. • Il DNA purificato viene microiniettato nel pronucleo di uova fertilizzate.

  4. L’embrione murino pre-impianto

  5. IL DNA VIENE MICROINIETTATO NEL PRONUCLEO MASCHILE DI UN UOVO FERTILIZZATO Integrazione (frequenza 10-30%) Le uova microiniettate soino introdotte nell’ovidotto di una madre adottiva Alcuni cuccioli nasceranno con il DNA integrato nel genoma (TOPI TRANSGENICI)

  6. TIPICHE APPLICAZIONI DEI TOPI TRANSGENICI IN BIOMEDICINA: • Analisi e dimostrazione dell’attivita’ di ONCOGENI • Analisi del ruolo patogeno di proteine impropriamente espresse • Analisi del ruolo patogeno di proteine umane mutate • Caratterizzazione di sequenze regolatorie (enhancers, promotori, locus control regions etc.)

  7. I proto-oncogeni c-Fos e c-Myc sono coinvolti nella crescita cellulare. • La loro sintesi e’ indotta da fattori di crescita in modo rapido e • TRANSIENTE • L’ espressione incontrollata stimola crescita cellulare incontrollata

  8. Lo sviluppo di un tumore richiede mutazioni multiple. Suggerito da studi epidemiologici e dimostrato da studi con topi transgenici

  9. La cinetica di comparsa di tumori mammari in topi transgenici che esprimono gli oncogeni myc, rasD o ambedue nella mammella sotto il controllo del promotore di MMTV dimostra la cooperativita’ delle mutazioni oncogeniche (carcinogenesi a piu’ stadi).

  10. MUTAGENESI MIRATAGenerazione di mutazioni specifiche in geni endogeni tramite RICOMBINAZIONE OMOLOGA IN CELLULE ES

  11. MUTAGENESI MIRATA: GENERAZIONE DI TOPI CHIMERICI TRAMITE INIEZIONE DI CELLULE ES IN BLASTOCISTI MURINE 3.5 DAYS MOUSE EMBRYO (BLASTOCYST) IN VITRO EXPANSION EMBRYONIC STEM CELLS (TOTIPOTENT) GENE TARGETING MICROINJECTION OF MUTANT ES CELLS INTO RECIPIENT EMBRYOS REIMPLANTATION IN PSEUDOPREGNANT FOSTER MOTHER CHIMERIC MICE ARE BORN

  12. - / + ALCUNI TOPI CHIMERICI TRASMETTERANNO LA MUTAZIONE ALLA PROGENIE + / + + / + - / + + / + INCROCIANDO TOPI ETEROZIGOTI PER LA MUTAZIONE SI OTTERRANNO MUTANTI OMOZIGOTI - / - STUDIO DEGLI EFFETTI DELLA MUTAZIONE

  13. Mutazioni specifiche tramite ricombinazione omologa: la strategia della “sostituzione” e la selezione positiva-negativa linearisation Plasmid seq. • L’intera regione tra le 2 regioni di omologia viene sostituita • Il marcatore di selezione positiva (Neo) e’ all’interno dell’omologia • Il marcatore di selezione negativa (HSV TK) e’ fuori dell’omologia • Una regione cruciale viene deletata o mutata nel vettore

  14. APPLICAZIONI BIOMEDICHE DELLA MUTAGENESI MIRATA TRAMITE RICOMBINAZIONE OMOLOGA • Analisi in vivo delle funzioni di geni specifici tramite la generazione di mutanti inattivi • Analisi delle funzioni di proteine mutanti tramite l’introduzione di mutazioni fini • Generazione di modelli animali di malattia (inattivazione di oncosoppressori, riproduzione di malattie dovute alla difettiva funzione genica - es fibrosi cistica, b-talassemia etc.)

  15. ANIMALI TRANSGENICI/KO: APPLICAZIONI IN BIOTECNOLOGIA • Produzione di proteine bioattive nel latte di mucche/pecore • Miglioramento delle caratteristiche commerciali/nutritive di animali da allevamento. • Produzione di anticorpi umanizzati • Produzione di animali con antigeni umanizzati per lo xenotrapianto d’organo

  16. Produzione di anticorpi umanizzati • Generazione di topi transgenici per i loci IgH e IgK umani (hIgH-TG, hIgK-TG) • Inattivazione mirata dei loci endogeni IgH e IgK (mIgH-KO, mIgK-KO) • Incrocio tra i topi dei diversi ceppi per ottenere un topo hIgH-TG, hIgK-TG; mIgH-KO, mIgK-KO che esprimera’ le catene H e K delle Ig umane

  17. Clonaggio animale: la tecnica Somatic cells (source of nuclei) Cloned sheep

  18. Specie animali clonate a tutt’oggi: • pecora • topo • mucca • capra • maiale

  19. Possibili applicazioni della ricombinazione omologa in animali da fattoria • Modelli di malattie umane piu’ vicini all’uomo (es. fibrosi cistica) • Rimozione di geni indesiderabili (es. il gene che codifica la proteina prionica PrP: pecore e mucche resistenti allo scapie/BSE)

  20. Clonare gli esseri umani?

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