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RNA 干扰( RNAi ) PowerPoint PPT Presentation


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Seminar I. RNA 干扰( RNAi ). 1804 组 张 慧 导 师 梁鑫淼研究员 2006 年 4 月 12 日. 主要内容. RNAi 简介 RNAi 的作用机制 RNAi 的产生 RNAi 的应用 小结. 什么是 RNAi ?. RNAi ( RNA interference )是指在生物体细胞内, dsRNA 引起同源 mRNA 的特异性降解,因而抑制相应基因表达的过程。 一种转录后水平的基因沉默 生物体内普遍存在 抵御外在感染的重要保护机制. RNAi 的发展历程大事记.

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RNA 干扰( RNAi )

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Presentation Transcript


Rna rnai

Seminar I

RNA干扰(RNAi)

1804组 张 慧

导 师 梁鑫淼研究员

2006年4月12日


Rna rnai

主要内容

  • RNAi简介

  • RNAi的作用机制

  • RNAi的产生

  • RNAi的应用

  • 小结


Rna rnai

什么是RNAi?

  • RNAi(RNA interference)是指在生物体细胞内,dsRNA引起同源mRNA的特异性降解,因而抑制相应基因表达的过程。

  • 一种转录后水平的基因沉默

  • 生物体内普遍存在

  • 抵御外在感染的重要保护机制


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RNAi的发展历程大事记

  • 1995,RNAi现象首次在线虫中发现。Cell,1995 ,81:611-620

  • 1998,RNAi概念的首次提出。Nature, 1998, 391(6669):806

  • 1999,RNAi作用机制模型的提出。Cell,2000,101(1):25-33

    在线虫、果蝇、拟南芥及斑马鱼等多种生物内发现

    RNAi现象。

  • 2001,RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉

    默现象。Nature,2001,411(6836):494-498

    RNAi技术被《Science》评为2001年度的十

    大科技进展之一。

  • 2002至今,有关RNAi的研究蓬勃开展,是分子生物学领域最为热门的方向之一。


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预备知识

dsRNA:双链RNA,包含正义链和反义链

Dicer:属于RNaseⅢ家族,是dsRNA的特异性核酸内切酶

siRNA:small interfering RNA ,RNAi的关键效应分子,21-23个nt大小的双链RNA

RISC:RNA-inducing silencing complex,具有核酸内切、外切以及解旋酶活性

RdRP:RNA-dependent RNA polymerases,是RNAi的调节因子,使RNAi可以在生物体内传递


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RNAi引发的基因沉默机制

Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.


Rna rnai

RNAi的分子生物学特性

  • RNAi是siRNA介导的转录后水平的基因沉默

  • RNAi作用针对的是靶基因的外显子序列

  • 高特异性,只针对同源靶向mRNA

  • 高效性,极低浓度的siRNA就能完全抑制基因表达

  • RNAi作用具有可传递性


Rna rnai

RNAi的研究方法

siRNA的设计

根据靶向mRNA进行设计

目前已证实的siRNA序列

http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.html

http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html

互联网上的帮助

http://www.ambion.com/http://www.promega.com.cn/

http://www.takara.com.cn/


Rna rnai

RNAi的研究方法

  • siRNA的制备方法

  • 体外制备

    ---化学合成siRNA

    ---体外转录合成siRNA

    ---用RNaseⅢ消化长片段dsRNA得到siRNA

  • 体内表达

    ---利用质粒或病毒载体表达siRNA

    --- PCR方法制备siRNA的表达框架


Sirna

siRNA制备方法比较


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应用

  • 基因功能研究

  • 基因治疗

    ---基因缺陷

    ---病毒感染

    ---肿瘤疾病

  • 其它应用

    ---植物代谢

    ---细胞信号传导通路


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基因治疗

  • 肿瘤细胞的MDR1基因编码的p-gp糖蛋白过度表达,引起肿瘤的MDR

  • Hait等针对MDR乳腺癌细胞的MDR1基因,使用化学合成的siRNA进行干扰

  • 结果表明:MDR1的mRNA和p-gp水平显著下降,细胞内紫杉醇和阿霉素积累增多,而且紫杉醇和阿霉素对乳腺癌细胞的细胞毒性大为增强。

Cancer Res,2003,63(7):1515-1519


Rna rnai

基因治疗


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植物代谢

  • 2003年,Ogita等首次报道RNAi技术在咖啡中的成功应用。

  • 选取咖啡因生物合成途径中的关键酶之一可可碱合酶,将siRNA转入植株内,从而抑制咖啡因的合成,转基因咖啡植株的咖啡因产量比正常植株低70%,可以用于生产低咖啡因含量的咖啡豆。

  • 是RNAi技术在药用植物代谢工程领域的经典范例。

Nature,2003,423(6942):823


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药用植物代谢

  • 2004年,RNAi在罂粟中成功应用。

  • 可待因酮与吗啡具有共同的前体分子-(S)-网状番茄枝碱。

  • 采用RNAi技术抑制可待因酮还原酶基因家族中所有基因的表达,使(S)-网状番茄枝碱和甲基- (S)-网状番茄枝碱积聚,从而提高罂粟中吗啡的含量。

  • 为增加植物中高药用价值的生物碱产量提供了成功的案例。

Nat Biotechnol,2004,22(12):1559-1566


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小结

  • 存在的问题

  • RNAi作用太过精确

  • RNAi产生原因未知,作用机制不确知

  • 如何使外源RNA进入哺乳动物体内

  • 如何将RNAi技术运用到临床试验


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小结

  • 前景与展望

  • RNAi是调控基因表达开关的“士兵”

  • 可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具。

  • 在未来的基因治疗中发挥作用

  • 对整个生物理论产生巨大而深远的影响

  • 谨慎利用


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参考文献

  • Cell,1995 ,81:611-620

  • Nature, 1998, 391(6669):806

  • Cell,2000,101(1):25-33

  • Nature,2001,411(6836):494-498

  • Science, 2002,296(17):1263-1265

  • Nature,2002,418(6894):244-251

  • Nature,2004,430(6894):161-164

  • RNA,2002,8(11):1454-1460

  • Nature,2003,423(6942):823

  • Nat Biotechnol,2004,22(12):1559-1566


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