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Produção de Etanol por via Fermentativa .

Produção de Etanol por via Fermentativa. Prof. Dr. Pedro de Oliva Neto poliva@assis.unesp.br.

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  1. Produção de Etanol por via Fermentativa . Prof. Dr. Pedro de Oliva Neto poliva@assis.unesp.br

  2. OBJETIVOS - 1. Entender o processo de fermentação alcoólica tanto do ponto de vista bioquímico, microbiológico como tecnológico. 2. Conhecer os fatores bióticos e abióticos que participam do equilíbrio dessa fermentação em escala industrial. 3. Caracterizar e relacionar os mecanismos ecológicos da microbiota e os fatores de inibição da levedura.

  3. INTRODUÇÃO. I - Produção de energia x alimentos – e a necessidade do uso de subprodutos . Atualmente, a produção de alimentos e a produção de energia estão interligados devido à corrida mundial por fontes renováveis de energia, através dos chamados Biocombustíveis - Bioetanol e biodiesel. Isso ocorre devido à escassez futura do petróleo e seus derivados, tais como diversos polímeros sintéticos, que já repercute na elevação dos preços internacionais deste combustível.A produção vegetal, animal e microbiana já são grandes fornecedores de alimentos, e também de substrato na forma de biomassa para obtenção de combustíveis renováveis, destacando-se as culturas de cana-de-açúcar no Brasil, beterraba na Europa, e milho nos EUA.

  4. O Brasil é o país que mais explora alternativas à utilização do petróleo no segmento de transportes . O etanol da cana-de-açúcar proveu, em 2006 13% da energia para transporte terrestre (excluindo estradas-de-ferro) e 28% do total do combustível líquido consumido por motores , porcentagem que alcançou 51% in 1988. Nos Estados Unidos, segundo maior produtor mundial de etanol (do milho), esta porcentagem era de 2.5% em 2004. Até esta data o Brasil foi o maior produtor mundial de bioetanol, contribuindo com quase 50% da produção total mundial, seguido pelos Estados Unidos. Desde 2005, a produção americana superou ligeiramente a brasileira. Juntos estes dois países produzem 70% do etanol mundial. Estima-se que a União Européia, com uma produção de quase 0.5 milhão de toneladas, tenha produzido cerca de 10% do bioetanol total mundial. Os custos da produção do bioetanol brasileiro são os mais baixos do mundo,o que tem levado aos produtores locais e investidores internacionais a investirem em várias novas destilarias e aquisição de terras por todo o país visando a produção de biocombustíveis.

  5. A utilização de áreas agrícolas para a produção de energia e alimentos no estado de São Paulo já sinalizam atualmente as limitações que teremos no futuro para grande parte do país e para o mundo (Tabela 1), quanto ao fornecimento de alimentos e energia a partir de biocombustíveis. Tabela 1 - Produção agrícola no estado de São Paulo – 2008____________________________________________________Cultura área agrícola em mil Ha.____________________________________________________Laranja 690Milho 850Trigo 75Soja 450Pastagens 9100Cana-de-açúcar 4900Área total 24500 ______________________________________________________Fonte: Dados coletados pela CAT – IEA –Secretaria da Agricultura

  6. II - PREVISÃO DA NECESSIDADE DE BIOCOMBUSTÍVEIS PARA O BRASIL.Ano 2025 - estima-se que serão necessários 205 bilhões de litros de etanol para atender 10% mercado, ou seja , cerca de 10 vezes a produção atual do Brasil. Isso demandará uma área de aproximadamente 29 milhões de Ha, (produtividade de 7000 litros de etanol/ha) ou seja, 6 vezes mais a área plantada hoje no estado SP, e superior à área agrícola total do estado de São Paulo. Isso sem contar com a substituição do diesel pelo biodiesel que irá requerer muita área agrícola, e hoje utiliza o óleo de soja como sua principal fonte de produção de biodiesel, e ainda o suprimento de outras formas de energia via biomassa (elétrica, mecânica, térmica). Portanto se somarmos o aumento da demanda energética, com o aumento da renda nos países pobres, e o conseqüente aumento da demanda internacional por alimentos, haverá grande aumento na demanda por áreas agriculturáveis, o que será uma grande limitação em escala global. Por esta razão a biomassa (vegetal, animal e microbiana) passará a ter um valor agregado cada vez maior, e terá que cumprir um papel fundamental tanto na produção de energia como alimentos.

  7. Cerca de 1/3 dos resíduos disponíveis podem suprir 10% do consumo de energia elétrica mundial. A utilização de biomassa incluindo resíduos agrícolas renováveis está sendo considerada em todo o mundo, como forma de solucionar os desafios futuros de suprimentos de energia e alimentos. A Comunidade Européia, bem como outras potências mundiais, estudam a possibilidade de substituição dos combustíveis fosseis na indústria, e consideram como uma possibilidade a substituição pela biomassa, não disponível na Europa no volume necessário. Uma das possíveis fontes de biomassa consideradas é a proveniente do Brasil. Neste aspecto, a possibilidade de aproveitamento dos nossos resíduos vegetais é uma perspectiva muito importante.

  8. Atualmente os únicos substratos viáveis para a produção de etanol via fermentativa são açúcares ou polissacarídeos facilmente hidrolisáveis. Porém o espectro de substratos podem incluir:a. caldo de cana e subprodutos do açúcar (melaço), da cana-de-açúcar ou beterraba. b. cereais hidrolisados (amido, arroz, trigo)c. tubérculos (mandioca, batata)d. fontes celulósicas (pó de serra, papel, bagaço, madeiras) - O mais viável economicamente é o caldo de cana e/ou melaço. A fermentação hoje é feita com a mistura destes dois componentes no preparo do mosto, ou apenas um deles dependo do tipo de destilaria e das condições dos preços internacionais do açúcar e do etanol. A cana de açúcar é a matéria prima que dá origem ao açúcar e a derivados tais como o melaço de cana no Brasil. - O etanol é produzido por um processo biológico de fermentação do melaço e ou caldo de cana produzindo etanol, CO2 , alguns ácidos e biomassa. - Tal processo não é asséptico, e o fermento é reutilizado desde o início até o fim da safra em inúmeras rodadas de fermentação . A mistura do mosto (açúcares fermentecíveis obtidos da composição do melaço, água e caldo) e o fermento, a Levedura Saccharomyces cerevisiae, resulta em imediato início do processo fermentativo, que sofre sucessivos reciclos.

  9. - Findado o processo, o fermento é então separado do mosto fermentado por centrifugação, e continuamente é misturado com o novo mosto, para fermentar. Toda essa operação é feita com contato parcial com a atmosfera e os microrganismos presentes no ar, água, tubulações e o substrato. O mosto apesar de sofrer um tratamento térmico para esterilização, sofre a reincidência de contaminates presentes na linha (tubulações e bombas).

  10. III - BIOMASSA COMO ALTERNATIVA DE FONTE RENOVÁVEL PARA SUPRIMENTOS DE ENERGIA. Estima-se que a quantidade de biomassa das florestas no planeta é da ordem de 2 trilhões de toneladas e representa hoje cerca de 14% do consumo mundial de energia primária. Processos envolvidos na utilização da Biomassa para produção de energia._______________________________________________________________Processo Produtos_______________________________________________________________Combustão direta (fornos/caldeiras) vapor/energia mecânica/elétricaGaseificação Gás de sínteseBiológica/Química Biogás (metano) metanol, etanol, biodiesel, etc________________________________________________________________

  11. O PROCESSO DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA NO BRASIL. • BIOQUÍMICA • A fermentação alcoólica é um processo anaeróbio de catabolismo de açúcares que a levedura utiliza para a produção de energia, utilizando a via glicolítica , a conversão do ácido pirúvico em acetaldeido e a redução desse a etanol, através da zinco desidrogenase alcoólica, conforme fluxograma:

  12. Glicose → glicose 6 P → frutose 6 P → frutose 1,6 diP → (+ ATP) (+ ATP) → Gliceraldeido 3 P + fosfodihidroxiacetona NAD+ ↓ NADH NADH ↓ NAD+ Ac. 1,3 diP glicérico glicerofosfato ADP ↓ ATP ↓ Ac. 3P glicérico Glicerol ↓ Ac. 2P glicérico ↓ ac. fosfoenolpirúvico ADP ↓ ATP Ac. Pirúvico ↓ CO2 Acetaldeido NADH ↓ NAD+ ETANOL

  13. Estequiometria: 1 C6 H12 O6 → 2 C2 H5 OH + 2 C02 180 92 88 (relação de massa - PM) Obs . 92/180 equivale ao fator de conversão teórico de glicose a etanol 0,511. Esse é o máximo rendimento teórico possível descrito por Gay-Lussac.

  14. Tabela 1 - Rendimento da fermentação alcoólica . ______________________________________ Produtos Massa (%) ______________________________________ etanol 48,4 anidrido carbônico 46,6 glicerol 3,3 ácido succínico 0,6 biomassa 1,2 total 100,1 ­_______________________________________ Considerando 100 kg de açúcar = 51,1 kg de etanol e 48,9 kg de CO2 , o rendimento teórico de 51,1 % por massa se denomina coeficiente de Gay-Lussac. Devido ao crescimento celular, nutrientes e oxigênio são necessários, assim o coeficiente de Pasteur é 48,4/51,1 = 94,7% do rendimento teórico de Gay Lussac (GL). Na indústria o rendimento é denominado eficiência alcoólica e está um pouco abaixo deste número.

  15. MICROBIOLOGIA EM DIFERENTES ETAPAS DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL CARBURANTE.

  16. Microganismos na cana de açúcar.

  17. Na cana de açúcar, aderidas aos colmos, folhas e raízes, encontram-se naturalmente vários tipos de bactérias, dentre elas: Leuconostoc (L. mesenteroides) , Bacillus (B.subtilis) , Aerobacter (A. aerogenes) , Escherichia (E. coli), Lactobacillus (L. . plantarum, )

  18. O caldo de cana possui um pH ácido (4,0-6,0) o que seleciona microrganismos mais acidófilos (afinidade com ambiente ácido), dentre os grupos destacam-se: Bactérias: Actinomicetos, Enterobactérias: Escherichia, Erwinia, Serratia Flavobacterium, Micrococcaceae: Micrococcus e Streptococcus Leuconostoc (L. citrovorum, L. dextranicum, L. mesenteroides) Bacillus (B. coagulans, B. circulans, B. megatherium) Pseudomonas (P. incognita) Lactobacillus (L. fermentum/reuteri , L. confusus, L. viridescens, L. plantarum) Xanthomonas

  19. Leveduras: Candida (C. didunii, C. fabiani, C. intermedia) Rhodotorula (R. palida, R. rubra) Hansenula polymorpha Torulopsis (T. nosvegica) Trichosporon cutaneum

  20. Devido às condições ácidas do caldo há um predomínio de bactérias láticas dentre elas: Leuconostoc mesenteroides subespécie mesenteroides , L.mesenteroides subespécie dextranicum, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus fermentum ou L. reuteri.Os níveis de contaminação do caldo dependem do clima e tempo de queima da cana, variando entre 105 – 109 cel/ml, mais freqüentemente 105-106 cel/ml.

  21. Microrganismos no caldo podem produzir biopolímeros com aspecto gelatinoso, viscoso, denominados gomas. As principais são: LEVANA (polímero frutose) - Bacillus, Aerobacter e Streptococcus .DEXTRANA (polímero glicose)- Leuconostoc mesenteroides, Bacillus.XANTANA (heteropolímero Glicose, Manose, Ac. Pírúvico, Acetil) - Xanthomonas campestris

  22. CONTAMINANTES DA FERMENTAÇÃO ALCOOLICA .

  23. Quando o caldo passa a ser fermentado pela levedura durante a fermentação alcoólica, esse passa a sofrer uma alteração no pH (faixa mais ácida entre 3,5-4,5) e nos constituintes químicos (o teor alcoólico, acidez, presença de sulfito, dentre outros) que acabam influindo na microbiota desta fase do processo.Sãoeles:

  24. Leuconostoc (L. mesenteroides) Lactobacillus (L. plantarum, L. fermentum, L. casei, L. acidophilus, L. bulgaricus, L.brevis, L. confusus, L. murinus, L. vaccinostercus ). Bacillus (B. Subtilis, B. stearothermophilus, B. coagulans) Micrococcus (M. lylae) Lactococcus (L. lactis) Enterobacter aerogenes Desses todos os mais freqüentes, estáveis no processo e resistentes ao etanol são as bactérias láticas e especialmente os Lactobacillus. Dentre eles, destacam-se L. fermentum .

  25. PRODUÇÃO DE ETANOL CARBURANTE - ETAPAS TECNOLÓGICAS:

  26. FLUXOGRAMA DE PRODUÇÃO DE ETANOL POR FERMENTAÇÃO.

  27. LAVAGEM DA CANA ← ÁGUA DE LAVAGEM ↓ MOENDA → BAGAÇO (Energia, vapor) ↓ CALDO MISTO ↓ PRÉ-AQUECIMENTO (70oC) ↓ SULFITAÇÃO (adição de SO2 - 300-1400 ppm) ↓ CALAGEM (adição de CaO - pH 6,8-6,9 ) ↓ FOSFATAÇÃO (mantém nível 300 ppm P2O5) ↓ TRATAMENTO TÉRMICO E DECANTAÇÃO (DECANTADOR 105oC./2 h) ↓ FILTRAÇÃO → LODO (AGRICULTURA) (PENEIRA ESTÁTICA OU FILTRO ROTATIVO) ↓ CALDO CLARIFICADO ↓ FABRICAÇÃO DO AÇÚCAR ↓ MELAÇO (SUBPRODUTO DA FÁBRICA AÇÚCAR) ↓ ← ÁGUA DE DILUIÇÃO E CALDO CLARIF. MOSTO (18-19 Brix - 30oC.) ↓ FERMENTO → TANQUE DE FERMENTAÇÃO (pH 3,8-4,5, 32-34oC) Acidificado (processos Batelada, Contínuo, Misto -ConBat ou BatCon) (pH 2,5) ↓ VINHO LEVURADO (Teor fermento 10-14%, álcool= 7,5% ↑ ↓ ARRT < 0,1%) CENTRIFUGAÇÃO → VINHO DELEVURADO ↓ (VOLANTE) DILUIÇÃO ↓ ↓ E DESTILAÇÃO ACIDIFICAÇÃO ← CREME LEVEDURA (H2SO4) – CUBA (40-80% massa úmida fermento)

  28. 2.1. Cuidados nas etapas anteriores à fermentação alcoólica são fundamentais para que o mosto esteja livre dos contaminantes ou produtos (biopolímeros, ácidos) por eles desenvolvido:

  29. A cana a ser moida não deve esperar mais do que 72 horas após o corte. Cana velha já esta deteriorada e concentrará na planta industrial´, microrganismos e produtos prejudiciais à fermentação (ex. gomas dextrana e levana). • b) Água de lavagem da cana - deve estar livre de microrganismos para não contaminar a matéria prima. Para isso, pode ser feita a calagem da água (pH 11) e circulação em circuito fechado, ou o tratamento com Ultra-Violeta ou Ultra-som, métodos ainda pouco utilizados.

  30. A cana-de-açúcar é moida em moendas com adição de água de embebição para uma eficiente extração, produzindo caldo de cana com aprox. 12-14 % (p/v) de açúcares fermentecíveis, pH 5,5-6,8. O nível máximo de etanol dependerá do Brix (12-20oBx) da composição do caldo de cana com melaço, que normalmente é feita, ficando entre 6 a 9 % (p/v) de etanol no “vinho delevurado” (caldo fermentado e centrifugado). O melaço (ou mel final) contém uma mistura de açúcares com concentração aprox. de 62-69% e o restante, água, pigmentos, gomas, cinzas (8%), proteína (3%) e ácidos.

  31. O melaço é rico em sulfito ou derivados (HSO3-) que são tóxicos para a levedura, afetando viabilidade celular e produção de biomassa e etanol. Além disso, é esse nutriente contém muito cálcio que também estimula a floculação celular. Há uma tendência para a introdução da clarificação do melaço (tratamento térmico c/ ou sem adição agentes coadjuvante, e posterior decantação), conseguindo a redução de aprox. 50% de sulfito e de cálcio.

  32. c) Após a moagem, separa-se o bagaço do caldo de cana, que é acumulado e serve para gerar energia (co-geração) através da queima dele nas caldeiras. O caldo misto (reunido da moagem de vários ternos da moenda), sofre filtração (peneiras vibratórias ou filtro rotativo), a torta, resíduo sólido separado dos filtros é usada como adubo nas plantações; o líquido, caldo filtrado segue o processo podendo ou não sofrer tratamento térmico através de aquecedores tubulares (105oC/2 h.) e decantação em tanque decantador específico (2 h.). O resultado é um caldo clarificado, limpo, claro e com baixa carga microbiana com pH variando entre 4,8 a 6,8.

  33. Cada hectare de cana plantada produz de 50 a 100 ton. cana. A proporção do caldo de cana produzido por cana moida é de 500 a 1000 litros/ton cana, média 850 litros/ton. cana dependendo da embebição na moenda; 25 a 40 litros de melaço por ton. cana. Cada ton. cana possui cerca de 130-140 kg de açúcar. O preparo do mosto envolve uma diluição apropriada de caldo de cana, melaço e água, geralmente de forma contínua, com misturador de linha.

  34. MISTURADOR EM LINHA.

  35. Geralmente trabalha-se com 30 a 100% de ART final de melaço em relação ao caldo de cana, porém esse número está aumentado a cada safra. Quando o etanol estava com preço muito baixo, e o açúcar alto, fazia-se etanol mais via melaço diluído com água a 18-20 Bx, quando ocorre o contrário, aumenta-se a produção de etanol com aumento do desvio do caldo para produção de etanol em detrimento do açúcar. Adição de uréia, fósforo, potássio, magnésio e micronutrientes deve ser feita com análise prévia dos nutriente já presentes no mosto (histórico), de forma a ser feita apenas uma complementação.

  36. Após a clarificação e esterilização do caldo para produção do mosto, ele sofre nova contaminação durante o trajeto das tubulações até as dornas de fermentação, por isso essa etapa deve ser rigorosamente controlada, sobretudo durante o resfriamento via trocadores de calor a placa.

  37. Trocador de calor a placas industrial.

  38. Produção do Inóculo – O preparo do inóculo do início de safra é feito misturando-se de forma não asséptica, em geral, o melaço diluído a 2% e complementado com minerais, (400 ppm de uréia, 50 ppm de P, 5 ppm Mn e Zn, e 50 ppm Mg), e adiciona-se 5% de massa úmida de fermento selecionado de preferência, isso é feito em tanques rústicos ou mesmo em tambores Assim que o Brix cair pela metade se o processo for Batelada, dobra-se o volume, e assim por diante, até as dornas de fermentação. Nessa etapa é feito o Processo de Cortes. Após o enchimento da dorna, o volume dessa é dividido em 2 dornas e preenchido com o volume complementar de mosto até que as 2 dornas fermentem, repetindo-se esse processo, até que todas as dornas sejam preenchidas com o mosto+fermento e aí, ao término da fermentação, inicia-se a centrifugação do vinho levurado.

  39. A centrifugação do fermento é uma etapa crítica do processo, já que serve para remover fisicamente os microrganismos contaminantes, ainda que parcialmente, e fatores nutricionais que podem ser reciclados e favorecerem os contaminantes, tais como peptídeos, proteína, presos em carcaças de leveduras mortas ou livres (Rothenbuehler et al. 1982). As centrífugas devem operar produzindo um creme de leveduras bem concentrado (50-80% v/v). O tratamento ácido do fermento na cuba deve ser agitado, aerado e moderado com pH superior a 1,9, usualmente pH = 2,5, e não muito demorado (igual ou inferior a 2 horas). Lavagens esporádicas do fermento com água, ou água e sais são benéficas pois ajuda na remoção de substâncias adsorvidas na parede celular, melhorando as trocas metabólicas, diminuindo a floculação e aumentando a viabilidade celular. A oxigenação do fermento nesta etapa é importante para a biosíntese de lipídeos da membrana.

  40. Fermentação Alcoólica - A fermentação se inicia quando é adicionado o inóculo (suspensão de leveduras), obtido da centrifugação do vinho levurado, com o mosto.A fermentação possui uma fase preliminar, a fase tumultuosa, onde ocorre intensa produção de etanol, gás carbônico e espuma, e a fase complementar caracterizada pela diminuição da fermentação e produção de gás. Um fermentação moderna dura em média 5-7 horas. O término é caracterizado pelo ARRT (açúcares redutores residuais totais) prox. a zero.     Controle dos contaminantes da fermentação alcoólica . Processos de fermentação utilizados variam da Batelada alimentada, onde o mosto é introduzido gradualmente, em algumas horas, e quando encerrada a fermentação, todo o vinho (mosto fermentado) é retirado, nesse caso o fermento já está nas dornas esperando o mosto. O Contínuo, onde introduz-se o mosto e fermento, simultaneamente e retira-se o vinho continuamente. Os processos mistos – ConBat, inicia-se com uma grande dorna que trabalha continuamente e depois distribue o vinho para várias dornas em batelada, e o BatCon - que funciona ao contrário.

  41. DORNAS DE FERMENTAÇÃO ABERTAS.

  42. DORNAS DE FERMENTAÇÃO FECHADAS

  43. . O controle da concentração de açúcar no mosto para evitar que o teor alcoólico não ultrapasse um valor máximo tolerado pela levedura (10-10,5 % v/v), nem que fique muito baixo, favorecendo a contaminação microbiana e desequilibrando o processo (necessidade de mais vapor no destilador). Acima de 114 g/l de etanol (Ghose, 1979), 117 g/l de etanol (Letorneau & Villa, 1987), ocorre forte inibição da taxa de crescimento e produção de etanol por S. cerevisiae. A concentração de levedura nas dornas que não deve ser baixa (maior ou igual a 10% v/v) para não tornar o processo lento e desequilibra-lo (a vazão de entrada do mosto dificilmente pode ser alterada, principalmente quando trata-se de destilaria anexa). Além disso, baixas concentrações de levedura diminuem a resistência ao etanol e outros fatores de estresse (Essia-Ngang et al. 1989; Vega et al. 1987). Concentrações elevadas de fermento (acima de 14-15%) são desnecessárias, difíceis de serem centrifugadas e operadas, e aumentam o estravazamento de nutrientes no meio, tais como certos aminoácidos, que são responsáveis pelo aumento na velocidade de crescimento e infecção por bactérias contaminantes (Oliva-Neto, 1995; Oliva-Neto & Yokoya, 1997, 1998).

  44. A floculação celular, causada por bactérias (Yokoya e Oliva-Neto, 1991; Santos & Yokoya, 1993), leveduras (Stratford & Keenan, 1988), polímeros (Jolly & Prakash, 1987) ou íons (Ca++, Fe++) conduz a perdas de fermento na centrifugação, recicla mais contaminantes, dificulta a ação dos agentes antimicrobianos, e induz a maior gasto com antiespulmantes e ácido sulfúrico (já que o tratamento ácido deve ser mais intenso).

  45. FIGURA 2: Fotografia eletrônica para exemplificar a floculação entre leveduras.

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