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酵母菌内 烃类合成途径的构建 PowerPoint PPT Presentation


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酵母菌内 烃类合成途径的构建. 报告人:张文倩. 背景. 目标:实现以 C11 , C12 为主要成分的中链烃类( C8-C14 )的生物合成. 脂酰 CoA. 葡萄糖. 脂酰 CoA 水解酶( 硫酯酶) C8-16. (人,小鼠). 自由脂肪酸. 丙酮酸. α- 双加氧酶 C10-16. (大米). 乙酰辅酶 A. 脂肪醛. 脂肪醛脱羰酶 C14-18. (蓝细菌). ACC. 丙二酰辅酶 A. 烷烃. 脂酰 CoA 硫酯酶.

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酵母菌内 烃类合成途径的构建

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Presentation Transcript


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酵母菌内烃类合成途径的构建

报告人:张文倩


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背景

目标:实现以C11,C12为主要成分的中链烃类(C8-C14)的生物合成


3165023

脂酰CoA

葡萄糖

脂酰CoA水解酶(硫酯酶)

C8-16

(人,小鼠)

自由脂肪酸

丙酮酸

α-双加氧酶

C10-16

(大米)

乙酰辅酶A

脂肪醛

脂肪醛脱羰酶C14-18

(蓝细菌)

ACC

丙二酰辅酶A

烷烃


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脂酰CoA硫酯酶

选取小鼠和人各一个基因命名为H1,H2,已经合成回来,连接在pUC18上。现H2已经连接到pYES2.0上。正在进行酵母转化


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α-双加氧酶

-


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十五醛

C10-C16脂肪酸

十三醛

十一醛

C9-C 15脂肪醛

壬醛

Assumption:

α-dioxygenase only accepts long- and middle-chain fatty acids with a carbon chain of at least ten carbon atoms as substrates


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脂肪醛脱羰酶

ORF1594

蓝细菌中产烃体系

PCC7942中的ORF 1594 和ORF 1593

ORF 1593


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C14-C18醛

Require O2

Require a reducing system:

NADPH and ferredoxin

and ferredoxinreductase

C13-C17烃


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基础工作:基因的连接导入

脂酰CoA

脂酰CoA水解酶

H1, H2

自由脂肪酸

  • HI,H2, 导入pYES2.0(含诱导性启动子GAL1),在酵母中进行单表达

  • 合成α-DOX(设计酶切位点)

  • 将α-DOX 和R2分别导入pYES2.0 ,分别采用不同强度的组合型启动子进行组合优化,进行单表达

    启动子强度:TEF1>TDH3>PGK1>TDH1

  • 将三个基因一起连接到同一pYES2.0上,实现共表达(均选取表达效果较好的启动子)

α-DOX

α-双加氧酶

脂肪醛

R2

脂肪醛脱羰酶

中链烃(Jet Fuel)

C7-15;C11


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工作方向

1 体内外检测酶活的方法

体内:将单个基因HI,H2 ,α-DOX ,R2分别导入pYES2.0,在酿酒酵母中进行单表达,酶利用细胞自身的底物生成对应产物,通过检测产物含量验证酶活。(色谱)

体外:需根据具体反应所需的条件(如是否需氧,是否需要还原体系等)构建酶活反应体系,进而提供相应底物,通过产物含量检测酶活。


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2 内源ACC启动子替换具体方案

已经要到PWJ1042质粒,可以进行URA3的同源臂替换,最终将ACC的原有启动子替换为其他强度较大的启动子如TEF1。


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3耶氏解脂酵母相关资料的查阅(索要整合型与游离型质粒,可用启动子)

4着丝粒质粒(比普通游离型质粒稳定,拷贝数低)

目前有三种营养标记型。

将基因导入着丝粒质粒中,试验其表达效果


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Thank you!


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