第三章 基因工程的常规技术

1. 第三章 基因工程的常规技术

2. 3.1 电泳 • 琼脂糖凝胶电泳 • 检测 DNA 是否真的存在，是否有降解现象，DNA 经限制性内切酶酶切后其产物的大小。目前最成熟的检测 DNA 的技术是琼脂糖凝胶电泳。 • 琼脂糖从海藻中提取的一种线状高聚物，在 0.7% 的琼脂糖浓度下，对 0.8 ～ 10kb 的 DNA 有最佳的分离效果。

3. 上样缓冲液： 含有 40% 的蔗糖，用于将 DNA 样品沉积在点样孔内，使样品不易扩散；还含有溴酚兰等指示剂，用于观察电泳的进程。 电压： DNA 样品都是约 pH8.0 进行保藏或分析的，在这一 pH 条件下， DNA 是带负电的。因此 DNA 的泳动方向是从负极走向正极。一般电场的大小为 5 伏 / 厘米左右。

4. DNA 构象：质粒 DNA 有三种构象，即闭合环状超螺旋 （ccc 型）、缺口环状 （nick）和线状，它们的泳动速率依次递减。    染色：溴化乙啶可很好地掺入到双链 DNA 中，在紫外光的激发下会发出橙红色的荧光，可用于对 DNA 进行染色和观察。

5. 3.2 杂交技术 • 分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其分子量大小。根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、Northern 杂交和 Western 杂交，以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。

6. 转移印迹技术Southern印迹杂交(southern blotting) Northern印迹杂交(northern blotting) Western印迹杂交(western blotting)

7. 电泳后含DNA的凝胶的处理 0.25N HCl浸泡10 min 水洗后浸泡于变性液（1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH）中30～60 min 水洗后，浸泡于中和液（1.5mol/LNaCl,0.5mol/L Tris-HCl,pH7.4）2次， 各15 min 虹吸印迹 （滤膜先用水浸湿，再用20xSSC[3 mol/L NaCl, 0.3 mol/L柠檬酸钠，pH7.0]浸泡 10 min。按图中操作[各层之间不能有气泡，凝胶上下颠倒放置]，室温下放置15～20 h。中间更换吸水纸） 取下滤膜后，用6xSSC漂洗2～3 min ，除去吸附于滤膜上的凝胶碎块，用滤纸吸 干，夹于两层干燥的滤纸中，于 80℃烘烤2小时，以固定核酸。可于4℃保存，用 于杂交。 杂交 1.预杂交（封闭DNA和滤膜上非特异性DNA结合位点，减少非特异性杂交反应， 即消除本底。试剂是小牛胸腺DNA，高分子化合物，或去脂牛奶）：把滤膜 用6xSSC浸湿后放入杂交袋，加预杂交液（0.2 mL/cm2膜），68℃6 h； 2.倒掉预杂交液后，加入含有探针的杂交液(0.25 mL/cm2膜)， 68℃36 h。 3.漂洗（按要求进行） 放射自显影检测杂交结果 1. Southern blotting

8. 2.. Nouthern blotting • Northern 杂交的总体过程与 Southern 杂交相似，只不过在 Blotting 过程中转移的是 RNA 而不是 DNA ,这种将 RNA 样品从凝胶转移滤膜的方法，其设计者为之起了一个与 Southern blotting 对应的名称， Northern blotting 。其后的分子杂交过程与 Southern 杂交过程中的分子杂交方式是一样的。Northern 杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的 mRNA 分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。

9. RNA的提取 由于RNase具有活性高、不易灭活的特点，在提取中必须防止RNase对RNA 的降解作用。细胞裂解液异硫氰酸胍可以抑制此酶活性。所有的器皿都应 用0.1％二乙基焦碳酸乙酯（DEPC） RNA变性电泳 电泳前应加变性剂，如甲醛、乙二醛等使RNA二级结构解体，才能使RNS 严格按相对分子质量大小分离。变性剂还可促进RNA与硝酸纤维素膜结合。 印迹转移 若待测的RNA片段较大，可预先将凝胶置于0.05mol/L NaOH中浸泡20 min， 以水解成较小的片段，再用20xSSC浸泡45 min，以加快RNA的印迹转移。 预杂交 杂交 洗膜 放射自显影或化学显色

10. 3. Westhern blotting • Western 杂交的总体过程也与 Southern 杂交相似，只不过在 Blotting 过程中转移的是蛋白质而不是 DNA ，这种将蛋白质样品从 SDS-PAGE 凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法，称为 Western blotting 。其后的杂交过程不是真实意义的分子杂交，而是通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探针不是 DNA 或 RNA， 而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。Western 杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。这种检测方法与其它免疫学方法的不同是，一方面可以避免非特异性的免疫反应，而且更关键的是可以检测出目标蛋白质的分子量，从而直观的在滤膜上显示出目标蛋白。

12. PCR工作原理 • PCR 技术是通过模拟体内 DNA 复制的方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩增出来的技术。其过程与 DNA 复制一样有三个步骤：模板变性，引物与模板复性，延伸。 PCR 扩增，主要的是引物设计，引物设计需要遵循一定的原则。用于 PCR 的 DNA 聚合酶种类很多，性质各异，可以满足不同的实验需要。 PCR 技术应用广泛，可以通过 A/T 克隆、 UDG 克隆等方法介导克隆，还可以通过同源重组、 DpnI 、重叠延伸等方法介导定点诱变。反向 PCR ，反转录 PCR 在基因操作中也扮演了重要角色。 PCR 技术还广泛应用于鉴定、诊断等领域。

14. 变性 95℃ 延伸 72℃ 退火 Tm-5℃ PCR工作过程

15. 生物芯片的定义 • 生物芯片（Biochip）是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。    基因芯片（又称 DNA 芯片）是生物芯片的一种类型，它是将 DNA 分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知样品中 mRNA 的表达量，也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定，为进一步了解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具。

16. 二、基因芯片技术的发展史 • 1989 年英国牛津大学的 Southern 等取得了在刚性载体表面固定寡聚核苷酸及杂交法测序的专利；与此同时俄罗斯和美国的科学家也提出了运用杂交法测定核酸序列（SBH）的设想。 1994 年研制出了一种基因芯片并用于检测 β-地中海贫血病的基因突变，筛选了一百多个 β-地中海贫血病已知的突变基因。 1995 年，一些国际大公司与研究机构合作共同开发具有商业价值的生物芯片及其相关的分析技术。 1997 年世界上第一张全基因组基因芯片——含有 6116 个基因的酵母全基因组芯片在斯坦福大学 Brown 实验室完成。从而使基因芯片技术在世界上快速得到应用。

17. 三、基因芯片技术的特点 • 基因芯片技术的特点的核心是微型化。芯片每平方厘米固体表面上可固定十万个 DNA 片段、数万个基因。一次分析可得到数万个基因的表达信息。微型化的另一方面是样品用量与试剂用量的微量化，用纳克级的 mRNA 、微升级的杂交液就能分析成千上万个基因的表达信息。这些都是其它研究技术所无法比拟的。     芯片制作及分析过程易于自动化。芯片设计制作可实现自动化，可根据要求将需要分析的基因制作成符合要求的芯片；杂交、洗片等过程都可实现自动化，工作效率大幅提高。

18. 四、生物芯片的分类 1．按载体材料    按载体材料可将芯片分为玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。目前，玻片材料因易 得、荧光背景低、应用方便等优点在国际上被广泛接受。通常是将玻片用化学方法处 理并联接上活性基团，如氨基、醛基、巯基等，使生物分子通过共价键或离子键与载体结合。 2．按点样方式     根据芯片点样方式不同，可分为原位合成芯片、微矩阵芯片和电定位芯片三类。    ① 原位合成芯片（Loci-synthetic DNA Chip）    ② 矩阵芯片（Microarray）    ③ 电定位芯片（Microelectronic） 3．按芯片固定的生物分子类型      根据芯片固定的生物分子类型可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片及芯片实验室。     ① 基因芯片或 DNA 芯片     ② 蛋白质芯片（Protein Chip）     ③ 芯片实验室（Lab-on-Chip） 4．按芯片使用功能分类      生物芯片因功能和用途不同可分为测序芯片、表达谱芯片和基因差异表达分析芯片 等。     ① 测序芯片     ② 表达谱芯片     ③ 基因差异表达分析芯片

19. 五、 基因芯片的制作 1．DNA 样品的来源 2．生物芯片的制作     生物芯片微阵列的制作技术按照制作方法可分为两大类，即原位合成和预合成后点样。预合成后点样是指制备芯片微阵列前，要固定的探针已经合成好，点滴系统需要做的就是把这些合成好的样品涂印或喷涂在基体上。原位合成方法则是由点滴系统将探针的组成部分逐步转移到基体上，同时实现探针合成和转移的目的。目前已经知道的基因芯片制作法有，接触点样法、喷墨法和原位合成法等。     ① 接触点样法    ② 喷墨法    ③ 光刻 DNA 合成法 3．制作生物芯片常用的工具 4．DNA 分子在刚性表面的固定     基因芯片技术包括三大部分，即芯片的制作；样品的标记；探针与标记样品的分子杂交等。     基因芯片制作的关键就是如何将大量的探针分子固定于支持物上，并保持探针分子的构像处于自然状态，使探针 DNA 分子能自由地与样品分子进行杂交。

20. 六、 基因芯片的杂交及结果分析 将不同条件下从某生物体中转录出来的所有 mRNA 经标记成为探针后，再与包含它所有基因而制成的芯片杂交。通过分析杂交位点及其信号强弱，就可得出不同情况下每个基因是否已表达及表达多少。 1．探针的标记     标记的方法通常是在反转录的底物中加入带有标记基团的寡核苷酸单体，通过反转录将标记分子掺入 cDNA 分子中。 mRNA 反转录标记方法直接影响 DNA 芯片分析结果的准确性及重现性。 2．杂交     在一定的条件下，分子间氢键的断裂与恢复是 DNA/DNA 、 DNA/RNA 分子间选择性结合的根本动力，这一过程称之为杂交。3．芯片结果读取与扫描仪 4．生物芯片的软件系统与数据处理

21. 七、 基因芯片的应用 • 1．基因表达分析；2．基因型及多态性分析； 3．杂交测序； 4．核酸和蛋白质相互作用的研究；5．疾病的诊断与治疗；6．药物开发； 7．在营养与食品卫生领域的应用； 8．在环境科学领域中的应用。