330 likes | 730 Views
HLA 高分辨分型技术及应用. 刘 湘. 博奥生物有限公司 HLA 服务部主任 生物芯片北京国家工程研究中心. 二零一三年八月二十七日. 公司 +国家工程研究中心模式. 2000 年 9 月 30 日在国家发改委、科技部、卫生部、教育部和北京市政府的大力支持下以清华大学和医科院等单位为依托发起成立了 : 博奥生物暨生物芯片北京国家工程研究中心。. 博奥 HLA 基因分型芯片系统. 每个点阵 2500 份样品. 2006 年,博奥 HLA 基因 分型芯片 系统开始承担中华骨髓库分型任务。. 3. 博奥 HLA 高分辨分型系统.
E N D
HLA高分辨分型技术及应用 刘 湘 博奥生物有限公司 HLA 服务部主任 生物芯片北京国家工程研究中心 二零一三年八月二十七日
公司+国家工程研究中心模式 2000年9月30日在国家发改委、科技部、卫生部、教育部和北京市政府的大力支持下以清华大学和医科院等单位为依托发起成立了: 博奥生物暨生物芯片北京国家工程研究中心。
博奥HLA 基因分型芯片系统 每个点阵 2500 份样品 2006年,博奥HLA基因分型芯片系统开始承担中华骨髓库分型任务。 3
博奥HLA高分辨分型系统 2009年,博奥HLA高分辨分型系统开始承担中华骨髓库高分入库任务。 4
HLA高分辨分型技术分类 • SSO(sequence specific oligonucleotide):针对HLA基因多个多态性位点设计出一整套等位基因组特异性探针。 • SSP(sequence specific primer):针对HLA基因多个多态性位点设计出一整套等位基因组特异性引物,扩增HLA基因特异片段。 • SBT(Sequencing Based Typing):PCR扩增所要分析的HLA基因片段,然后对HLA基因片段进行测序,对测序结果进行分析,可以直接得到高分基因型。
HLA基因高度复杂性 • HLA基因是人类基因中最复杂的基因复合体。高度的多态 • 性、高GC含量、高度的同源性。 • HLA基因间高度的同源性和多态性导致测序分型时产 • 生大量的模棱两可基因组合。 http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla
难点1:等位基因有效扩增 等位基因1扩增失败 等位基因2 GACCACTGA GACCACGTA 等位基因1扩增效率低 CGATAT TGCCAAG DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 ACGTGACGGTTCTTTGCTATACG 等位基因2
等位基因有效扩增策略 • 选择等位基因保守序列区域以及HLA基因位点间同源性低的区域设计引物。 • 引物设计上考虑HLA基因特异扩增同时,保证等位基因扩增的均一性。 • 采用多种PCR扩增策略,有效扩增HLA基因。
难点2:模棱两可等位基因组合区分 模棱两可等位基因组合 确定的等位基因组合
模棱两可等位基因组合 等位基因1 C C 等位基因2 C C C C = NN(A/T)NN--------------NN(C/G)NN NN(A/T)NN--------------NN(C/G)NN T A A A T T T A A A T T G G NNANN----------------NNCNN G G 等位基因1 G G 分离等位基因(单倍型) NNTNN----------------NNGNN 等位基因2 NNTNN----------------NNCNN NNANN----------------NNGNN
基于SSP和SSO原理解决方案 特异性引物 5' 3' 5' DNA 聚合酶 T C A A --------G G A A AGCC C G C G T T G G G G G G G G G G G G C C C C C C A A A T G G G C C C AG C C C T T T G G G G G G A A A C T T T T T C C C 特异性探针 TGAAG TGAAG
基于二代测序解决方案 等位基因1 等位基因2 等位基因2 HLA基因扩增子 油相 水相 半导体测序 焦磷酸测序
读长与模棱两可问题解决关系 等位基因1 C C 等位基因2 C C C C A A T T T T A A A A T T 270bp 适合HLA分型的二代测序平台 454:400~800bp Ion Torrent:400bp MiSeq:2X250~300bp PacBio:~5Kb G G G G 等位基因1 G G 等位基因2
博奥HLA分型的特点 技术特点 质量特点 16
技术特点 17 • 高精度:解决等位基因杂合歧义、外显子多态性位点导致的模棱两可( Ambiguous Allele Combinations)的问题。 • 高准确性:采用多种策略有效避免HLA多态性影响,以及独特的GSSP引物设计、GSSP分型软件,保证HLA高分辨分型的准确性。 • 高通量:博奥HLA高分分型可达96,000份样品/年。
HLA GSSP分型软件 图形用户界面 测序峰图 识别模块 序列比对 模块 引物筛选 模块 分型模块 跨操作系统虚拟机 Java 操作系统 Mac OS Windows Linux 高通量、高准确性、高精度
二代测序-HLA高分辨分型 目标基因富集 “油包水”PCR 文库制备 测序 数据分析
HLA基因位点平均reads数 reads数:测序读取序列数量 8通道PTP板每个通道的HLA基因位点平均reads数
质量特点 连续7年的2%骨髓库分型样品抽检准确率达99.99%。 18次美国 UCLA DNA Exchange实验室HLA分型能力验证活动,正确率均达到100% 。 连续9次参加卫生部临检中心的“HLA分型质量控制”室间质控,正确率均达到100%。
质量控制流程 • 样品准备与运输 • 根据《生物样品质控及运输要求》用于指导样品的前期准备及运输条件;《样品检测需求单》用于您提出对样品或检测的要求 • 样品储存和管理 • 样品管理库能够有效记录样品位置,建立样品名片;超大的存储空间,规范的存储设施保证了样品的安全、有效 培训及考核、 SOP文件、 过程质控、 实验监督、 内部抽检 • 实验操作严格遵照SOP • --双人复核 • 60个SOP文件涵盖样品质检、测序实验、数据分析、仪器操作、环境控制等全部过程;关键步骤采取双人复核的方式,确保无误 • QC层层把关 • 样品QC、原材料QC、检测结果QC、内部抽检等多重质控,检测报告严格的审核、批准过程确保数据质量 样品QC 引物QC • 结果报告发送 • 数据经过专业的软件分析;结果报告经过层层复核、确认,可保证数据的不可修改、完整及保密要求 内部抽检
质量控制流程 样品接收、整理 电泳检测 DNA提取、分装 质谱、CE检测,引物验证实验 插入质控品,并设空白对照,样品双人核对并拍照存档 基因扩增 引物合成 扩增产物纯化 电泳检测 测序反应 分区管理 仪器校准 双 人 复 核 测序产物纯化 测序 数据收集,软件分型 质谱、CE检测,引物验证实验 比较质控品结果 结果确定 结果不确定 进一步实验 引物合成 比较质控品结果 结果确定 27 27 结果报告
HLA分型总样品数 HLA分型总样品数超过22万份 从2006年至今,博奥HLA分型实验室已完成中华骨髓库超过22万份样品的HLA分型检测。 29
HLA新基因型 博奥已发现35个HLA新基因型,并得到WHO命名委员会(WHO Nomenclature Committee)的命名。
一代、二代测序平台应用 一代测序平台应用 • 肿瘤个体化医疗(EGFR、KRAS等) • 遗传病致病基因检测 二代测序平台应用 • 致病微生物基因组测序 • 遗传病致病基因检测 • 肿瘤个体化医疗
谢谢! 博奥生物有限公司 (生物芯片北京国家工程研究中心) 北京市昌平区生命科学院路18号 邮编:102206电话: 86-10-8071 5888 / 8072 6868 传真: 86-10-8072 6898 32