肿瘤学
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肿瘤学. 300-500 例 /10 万. 1. 细胞凋亡与肿瘤. 胡新荣. 2. 第一节 细胞凋亡的概念和生物学意义. 概念: 是有基因控制的个别细胞发生的主动有序的死亡过程,具有特征性的形态和生化改变。分生理和病理性 凋亡。 生物学意义: 选择性地清除多余、无用、有害细胞、衰老细胞. 3. 第二节 细胞凋亡的形态特征, 光镜下. 凋亡细胞、凋亡小体散在分布。 凋亡细胞:体积缩小,胞浆红染,胞核皱 缩 , 染色质浓块状。 凋亡小体:球形或椭圆形,红染,为膜包

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肿瘤学

300-500例/10万

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细胞凋亡与肿瘤

胡新荣

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第一节 细胞凋亡的概念和生物学意义

概念:是有基因控制的个别细胞发生的主动有序的死亡过程,具有特征性的形态和生化改变。分生理和病理性凋亡。

生物学意义:选择性地清除多余、无用、有害细胞、衰老细胞

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第二节 细胞凋亡的形态特征,光镜下

凋亡细胞、凋亡小体散在分布。

凋亡细胞:体积缩小,胞浆红染,胞核皱

缩 ,染色质浓块状。

凋亡小体:球形或椭圆形,红染,为膜包

裹胞质或核碎片。

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电镜下

  • 细胞表面连接结构消失,光滑轮廓

  • 细胞皱缩,胞质中细胞器集中;胞膜出芽或气泡;细胞器保持完整性

  • 核改变:核质固缩坚实;边集;核膜皱折

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细胞凋亡与坏死的区别

区别点 细胞凋亡 坏死

原因 生理/病理性 病理性

形态特征:

分布 单个散在 片状

胞膜 完整 不完整

细体 变小 肿胀

核质 浓缩,核膜下 分散絮状

胞器 完整 肿胀破碎

凋亡小体 有 无

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凋亡 坏死

周围炎症 无 有

生化特征:

调节 基因调节,主动 无,被动

DNA降解 有规则,早期 不规则,

200bp片段, DNA大片段

梯状特征电泳 涂状电泳

蛋白合成 有 无

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第三节 细胞凋亡发生的酶学变化

核酸内切酶:在核小体连接区切割DNA

形成180-200bp片段,核破碎

蛋白酶(Caspases):消化细胞器蛋白,

使细胞皱缩

谷氨酰胺转移酶:使粘性蛋白交联,网

罗细胞器,形成凋亡小体

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第四节 细胞凋亡发生过程中活性氧、钙超载、线粒体损伤的作用一、活性氧

Active Oxygen,Reactive Oxygen Spiecies,ROS

是活泼的氧自由基和具有氧自由基反应性的其他含氧物质的总称,包括:O-2、.OH、O.2、H2O2 。

过量ROS引起凋亡:直接损伤DNA;损伤蛋白,灭活酶;影响转录;攻击细胞膜,影响信号传导和线粒体稳定

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二、钙超载

钙超载引起凋亡:钙为第二信使,可活化核酸内切酶,舒展DNA;活化蛋白激酶C,从而使cAMP增加;激活NF-kB。

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三、线粒体损伤

线粒体损伤引起凋亡: 通透性升高,析出凋亡启动因子如细胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)和凋亡诱导因子(AIF),从而激活Caspase9 和Caspase3,AIF还直接激活核酸内切酶;改变细胞氧化还原潜能

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第五节 凋亡发生的范围及诱导与抑制因素

  • 范围:多数正常组织,在胚胎发育和机体成长过程中,细胞分裂和凋亡是平衡的

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一、诱导凋亡的因素:

  • 物理因素:紫外线、高温

  • 激素:糖皮质激素 淋巴细胞

  • 细胞因子:TNF、Fas/Apo-1

  • 免疫因素:T淋巴细胞杀伤

  • 细胞毒药物:多种抗癌药

  • 微生物:细菌、病毒

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二、抑制细胞凋亡的因素

  • 细胞因子:Ils、CSF、NGF

  • 蛋白激酶C(PKC)激活剂:TPA

  • 微量元素锌:抑制钙激活的核酸内切酶

  • 激素:睾丸酮、雌激素

  • 其他因素:EBV、苯巴比妥

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第六节 细胞凋亡的信号转导

  • 细胞凋亡信号转导的环节

  • ⑴ 各种触发因子与细胞膜受体结合,触发凋亡反应,第一信号系统

  • ⑵ 激活信号传导通路,促进凋亡相关基因的表达

  • ⑶ 某些凋亡相关基因的表达激活内切酶等效应分子,促进细胞凋亡

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细胞凋亡信号转导系统的特点

  • 多样性:多种细胞凋亡信号转导系统

  • 偶联性:增殖、分化与凋亡

  • 同一性:不同凋亡因素可使用同一凋亡信号转导通路

  • 多途径:同一凋亡因素可使用多条凋亡信号转导通路

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第七节 细胞凋亡的基因调控

  • 促进细胞凋亡基因:野生型p53,腺病毒EIA,细胞表面抗原Fas,c-myc, TGF-b1、bax,TNF

  • 抑制细胞凋亡基因:突变型p53,bcl-2、pRb、ras、EBV 的BHRF-1

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一、P53基因

  • 80年代初,癌基因;89年,抑癌基因

  • ●野生型p53:被DNA损伤激活,阻G1/S进展,轻者修复,重者凋亡,避免DNA突变;激活bad,诱导凋亡

  • ●突变型p53:抑制c-myc界导的凋亡

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二、Fas基因

  • 细胞膜蛋白,属于肿瘤坏死因子(TNF)受体和神经生长因子(NGF)受体家族

  • 抑制肿瘤细胞增殖,诱导凋亡

  • Fas需与其配体结合发挥凋亡作用。其天然配体就可能是凋亡信号(包括其抗体)

  • Apo-1: 也是细胞膜蛋白,具有Fas相似的作用

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C myc

三、c-myc基因

  • 双重作用

  • 抑制因子存在(抑癌、低血清、抑周期因子),c-Myc促进细胞凋亡

  • 刺激因子存在,c-Myc促进细胞增殖,抑凋亡;与bcl-2协同

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Tgf b1

四、TGF-b1

抑制肝细胞增殖、促进其凋亡

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Bcl 2

五、 bcl-2基因

  • 抑制细胞凋亡(有选择),延长细胞寿命;成熟和衰老细胞中不表达或低表达

  • Bcl-2和bax基因功能相反,即bcl-2抑制凋亡,而bax促进凋亡(诱导细胞色素C释放、激活Caspase)

  • Bcl-2/bax、bcl-2/xl 抑制凋亡;bcl-2/bcl-xs、bax/bad促进凋亡

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六、pRb

野生型pRb抑制凋亡; pRb高表达抑制p53诱导的凋亡;pRb、P107、P130缺乏诱导凋亡。

突变型pRb对凋亡无影响。

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第七节 细胞凋亡与肿瘤一、凋亡与肿瘤发生发展及转移

  • 在肿瘤中细胞凋亡小于增殖

  • 细胞凋亡率 约为1%-9.5%,淋巴瘤最高,腺癌次子,肉瘤最低

  • 细胞凋亡与肿瘤发生发展及转移都有关

  • 在肿瘤细胞中,促进凋亡的基因功能增强,抑制凋亡的基因功能减弱

  • 机体免疫反应诱导瘤细胞凋亡的功能不全


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二、细胞凋亡与肿瘤的防治

  • 治疗后发生凋亡是肿瘤化疗疗效的标志之一;增加凋亡指数与增生指数的比值已成为新的治疗目标;同时诱导细胞凋亡已成为筛选抗癌药物的新标准。

  • 在激癌和促癌阶段诱导细胞凋亡可使癌变逆转

  • 化疗、放疗、热疗、免疫治疗都可诱发细胞凋亡

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防治举例

放疗:淋巴瘤、腺瘤在照后凋亡增加,故对放疗敏感;肝癌、恶黑在照后凋亡不增加,故对放疗不敏感

化疗:抑增殖促凋亡。顺铂、阿霉素、维甲酸等

免疫治疗:抗FAS/APO-1抗体使淋巴瘤凋亡增加

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第八节 细胞凋亡的检测方法

基于三条:细胞膜完整性;DNA断裂;细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS)

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一、形态学观察方法(一)

  • HE染色、光镜观察:圆、核深染、染色质团块状、胞质浓缩、胞膜“出芽”

  • AO(吖啶橙)染色、荧光显微镜观察:

  • ⑴活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光

  • ⑵凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,膜有“凋亡小体”

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形态学(二)

  • 台盼蓝染色:活或凋亡细胞,其膜完整,细胞不着色;死亡细胞,着蓝色

  • 透射电镜:

  • ⑴细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集、细胞器集中

  • ⑵细胞膜起泡和出“芽”

  • ⑶凋亡小体和凋亡小体被吞噬细胞吞噬

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二、DNA凝胶电泳

  • 检测原理:凋亡细胞DNA断裂有规律,180~200bpDNA片段;坏死细胞DNA断裂无规律

  • 结果判断:活细胞,一条区带;凋亡细胞,梯状条带;坏死细胞,血抹片状连续性条带

  • 存在问题:不特征;早期凋亡无DNA断裂;灵敏性差,需106细胞

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Elisa

三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定

  • 原理:DNA断裂有核小体,核小体由组蛋白和DNA片段构成;抗组蛋白抗体

  • 方法简单,操作容易

  • 敏感性高,可检测5×102细胞

  • 半定量;全定量不精确

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四、流式细胞仪定量分析

  • 原理:凋亡细胞膜通透性介于正常细胞和坏死细胞之间

  • 特点:

  • ⑴检测细胞数量大,较准确

  • ⑵可作许多相关分析

  • ⑶可确定凋亡细胞所处细胞周期

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1 hoechs pi

1、Hoechs-PI双染色法

  • 正常细胞不着色,荧光很浅

  • 凋亡细胞主要摄取Hoechs,强蓝色荧光

  • 坏死细胞主要摄取PI(碘化丙啶)红色

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2 dna

2、DNA片段原位标记法

  • 原理:荧光素、地高辛或生物素标记的DUTP和TdT与凋亡细胞DNA链裂解后3`羟基端结合

  • 原位缺口转移:用DNA多聚酶将标记物接到DNA断端

  • 原位缺口末端标记技术:用TdT将标记的DUTP接到DNA断端

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3 annexin v pi

3、检测细胞膜成分变化的Annexin V联合PI法

  • 原理:细胞凋亡早期细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外侧;磷脂结合蛋白V(Annexin)同其有高度结合能力,可作为探针

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V-PI

  • 结果判断:

  • ⑴正常细胞 V、PI 均 低染

  • ⑵凋亡细胞 V高染,PI低染

  • ⑶坏死细胞 V、PI 均高染

  • 应用价值

  • ⑴凋亡早期;灵敏,假阳性低;简单省时;结果可靠,是目前最为合理的方法

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0、目前治疗肿瘤新设想—诱导凋亡

  • 导入野生型p53抑制肿瘤增生;下调突变型p53、bcl-2的活性与表达,减弱其对细胞凋亡的抑制;抑癌基因引入瘤细胞,降低致瘤性,使肿瘤逆转为正常细胞;引入某些细胞因子,抑制肿瘤恶性表型,使细胞丧失致瘤性;应用点突变技术,使异常表达基因失活或修复突变基因;导入药物敏感基因,有助于细胞凋亡

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0、凋亡与其他疾病一、细胞凋亡异常增加见于相关疾病

  • 神经系统退行性病变

  • 骨髓发育不良综合征

  • 缺血性损伤 心梗、肾小球肾炎

  • 肝病变 病毒性和酒精性肝炎

  • AIDS

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二、细胞凋亡过度减少相关疾病

  • 自身免疫性疾病: SLE、GN

  • 肿瘤:激素依赖性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和淋巴造血肿瘤

  • 各种病毒感染:腺病毒、疱疹病毒

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