2 estructura y propiedades de prote nas
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2 estructura y propiedades de prote nas

2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS.

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http://www.expasy.ch/tools/


2 estructura y propiedades de prote nas

2. Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de pollo.PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.


Para qu purificar una prote na

¿Para qué purificar una proteína?

Consumo humano

Terapia

Cosmético

Suplementos alimenticios

Limpiadores entre otros


Investigaci n

Investigación

  • Caracterización de la actividad biológica de la proteína.

  • Para estudios sobre la estructura-función

  • Establecer relaciones evolutivas entre organismos


Gu a b sica para la purificaci n de una prote na

Guía básica para la purificación de una proteína


Selecci n de la fuente de la prote na

SELECCIÓN DE LA FUENTE DE LA PROTEÍNA.

La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como:

  • la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se aísla la proteína,

  • la cantidad de la proteína de interés en el tejido y

  • cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida, que ayudará en su estabilización y su aislamiento.


Ldh de m sculo de gallus gallus

LDH de músculo de Gallusgallus

Participación de la LDH

en el ciclo de Cori


Fases para la purificaci n de una prote na

Fases para la purificación de una proteína

Fase I.El objetivo inicial es la obtención del homogeneizado o extracto crudo y su clarificación o concentración.

Fase II.El objetivo principal es remover una cantidad importante de contaminantes que pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los métodos más utilizados para eliminar proteínas contaminantes es el de la precipitación.

Fase III. El objetivo es obtener una proteína pura o con mínimas trazas de contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinación de varios métodos cromatográficos, como la cromatografía de exclusión molecular, intercambio iónico, interacción hidrofóbica y de afinidad.


M todos para la ruptura de las c lulas

FASE I

Métodos para la ruptura de las células

Ruptura mecánica

Ruptura química o fisicoquímica


French press

French press


Ruptura por ultrasonido

Ruptura por ultrasonido


Homogeneizadores y licuadora

Homogeneizadores y licuadora


Tama o de las prote nas propiedad utilizada para su separaci n

Tamaño de las proteínas, propiedad utilizada para su separación.

  • El tamaño de las proteínas es medido usualmente en masa molecular, aunque algunas veces se menciona su longitud y diámetro (en Å).

  • El peso molecular es la masa de 1 mol de proteína, usualmente se expresa en daltones.

  • Un daltón es la masa atómica de un protón o neutrón.


C mo separar las prote nas en base a su masa o tama o

¿Cómo separar las proteínas en base a su masa o tamaño?

La electroforesis en gel de poliacrilamida.

La cromatografía en filtración en gel o exclusión molecular

Schematic of a size-exclusion chromatography column


Centrifugaci n

FASE I

Centrifugación

  • Se somete a la fuerza de gravedad.

  • Tamaño, forma y densidad de las proteínas o de organelos


Diferentes compartimentos u organelos diferentes prote nas

FASE I

Diferentes compartimentos u organelos, diferentes proteínas


Diagrama de flujo para la obtenci n de diferentes fracciones subcelulares

FASE I

Diagrama de flujo para la obtención de diferentes fracciones subcelulares

Centrifugación diferencial


Centrifugaci n en gradiente

FASE I

Centrifugación en gradiente


La fuerza centr fuga relativa rcf

FASE I

La fuerza centrífuga relativa (RCF)

  • se calcula con la siguiente ecuación:

  • Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con una distancia r (expresada en mm). El radio usado es la distancia del centro del eje del rotor a la posición intermedia del tubo.


Precipitaci n para remover contaminantes y o concentrar la muestra

FASE II

PRECIPITACIÓN para… Remover contaminantes y/o concentrar la muestra

  • Precipitación:

  • cambio de pH,

  • incremento en la temperatura,

  • adición de solventes,

  • moléculas cargadas, etc.

    El método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH4)2SO4.


Como ocurre la desnaturalizaci n de las prote nas

Como ocurre la desnaturalización de las proteínas


Solubilidad

FASE II

Solubilidad

  • Es la cantidad de solutoquepuededisolverse en un solvente.

  • La estructura 3-D de la proteínaafectasuspropiedades de solubilidad.

  • Cadaproteínatieneunasolubilidadcaracterística en un ambientedefinido (amortiguador, tipo de solvente, pH, fuerzaiónica, temperatura, etc.)


Salting in y salting out

FASE II

“Salting in” y “salting out”

“Salting in” Las proteínas  solubilidad al  [iones]

“saltingout” [iones] la proteína solubilidad y se agrega


Separar las prote nas pp por centrifugaci n

Separar las proteínas pp por centrifugación


C mo calcular la concentraci n de sulfato de amonio a utilizar

FASE II

¿Cómo calcular la concentración de sulfato de amonio a utilizar?


Existen tablas que nos indican cuanto a adir de sulfato de amonio

FASE II

Existen tablas que nos indican cuanto añadir de sulfato de amonio


Y tambi n en internet

Y también en internet

  • http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl

  • Conocer:

  • Sulfato de amonio sólido

  • Conocer el volumen de la solución

  • Y la concentración final de la sal


Eliminar la sal

Eliminar la sal

  • Una vez que se obtiene el pp de una mezcla proteína hay que eliminar la sal o medio utilizado para la precipitación.

  • La sal puede interferir en los posteriores pasos de purificación

  • La sal puede alterar las propiedades biológicas de la proteína


Bajar o eliminar la concentraci n de sal

Bajar o eliminar la concentración de sal

2. Cromatografía filtración en gel,

para perder las moléculas de bajo peso molecular (Sefadex-G25).

  • Diálisis

3. Utilizar filtración a través de membranas de diámetro especifico.


C mo vamos a purificar a la lactato deshidrogenasa de m sculo de bovino

¿Cómo vamos a purificar a la lactato deshidrogenasa de músculo de bovino?

Fase I


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