اندازه گيري اندكس هاي CBC

1. اندازه گيري اندكس هاي CBC ياسر يوسف پور كارشناس مسئول آزمايشگاه خليل آباد مهر88

2. هماتولوژي: • هماتولوژي علم مطالعه سلولهاي خوني وانعقادي راشامل ميشود.اين دربرگيرنده بررسي غلظت،ساختمان وعملكردسلولهاي خوني وپيش سازهاي آنهادرمغزاستخوان،بررسي آندسته ازتركيبات شيميايي پلاسماياسرم كه ارتباط نزديكي باساختمان وعملكردسلولهاي خوني دارندونيزبررسي عملكردپلاكتهاوپروتئينهاي انعقادي است .

3. هموگلوبين : • هموگلوبين يك پروتئين كونژوگه است كه بعنوان وسيله اي براي انتقال اكسيژن ودي اكسيدكربن خدمت مي كند. • درحالت اشباع كامل هرگرم هموگلوبين 1/34ميلي ليتراكسيژن راحمل مي كند. • يك مولكول هموگلوبين ازدوجفت زنجيره پلي پپتيدي (گلوبين)وچهارريشه پروستتيك (هم)كه هريك ازآنهاداراي يك اتم آهن فرواست،تشكيل يافته است. • هنگاميكه هرريشه ”هم“بايك مولكول اكسيژن تركيب مي شودبه آن اكسي هموگلوبين(Hbo2)مي گويند. • هنگاميكه آهن هم اكسيدشده وبه فرم فريك تبديل شودمتهموگلوبين (همي گلوبين Hi)تشكيل مي شودكه قابليت حمل اكسيژن يا دي اكسيدكربن راندارد.

4. اندازه گيري غلظت Hb: • روش سيان مت هموگلوبين (همي گلوبين سيانيدHiCN)روشي آسان وقابل دسترس بامحلول استانداردپايداراست. • فري سيانيدپتاسيم هموگلوبين رابه همي گلوبيت سيانيد(HiCN)تبديل مي كند.تركيب آخري داراي طيف جذبي گسترده ايست كه حداكثرآن در540نانومتراست. • محلول درابكين( تغييريافته ): • فري سيانيدپتاسيم K3Fe(CN)6 --------------0.2gr • سيانيدپتاسيم KCN----------------------0.05gr

5. فسفات دي هيدروژن پتاسيم(بدون آب) KH2Po4-----0.14gr • دترژنت غيريوني(Sterox SEياTriton X100)-----0.5-1ml • آب مقطر----------------------------------------تا1000ml • روش كار: • 20ميكروليترخون به 5ميلي ليترمعرف اضافه مي شود(1:251)بخوبي مخلوط نموده وپس از3دقيقه جذب نوري آن دربرابربلانك معرف در540نانومتراندازه گيري مي شود. • محاسبه : Hb(g/dl)=At/As*Cs/100*251 • وجودپروتئينهاي غيرطبيعي درپلاسما،هيپرليپمي،افزايش شمارش لكوسيتها(بيش از30هزار)ياوجودقطرات چربي ايجادكدورت كرده ومقدارHbرابطوركاذب بالانشان مي دهند. • بسته بودن تورنيكت به مدت طولاني باعث غليظ شدن خون وافزايش كاذب Hbمي شود. • خطاها: • 1-خطاهاي ناشي ازنمونه

6. 2-خطاهاي ناشي ازوسايل • 3-خطاهاي ناشي ازكاربر • 4-خطاهاي ناشي ازروش كار • استفاده ازكووت نامناسب مي تواندخطاي عمده اي ايجادكند،استفاده ازكووت هاي Flow-throuhبهتراست. • خطاهاي انساني رامي توان باآموزش مناسب،درك اهميت باليني آزمايش،پيروي كردن ازدستورالعملهاي كتبي وشفاهي وآشنابودن باتجهيزات ومنابع خطاكاهش داد. • خطاهادراثرخستگي افزايش مي يابندومعمولادرنزديكي انتهاي روز كاري خطابيشتراست. • تكنولوژيستي كه ذاتاونيزدراثرآموزش باحوصله ودقيق بوده وبه كارخودعلاقه مندباشدكمتردچارخطامي شود. • استفاده ازتجهيزات خودكاركه امروزه بطورگسترده مورداستفاده قرارمي گيرنداغلب خطاهاي انساني راحذف مي كنند. • درروش سيان مت هموگلوبين همه مشتقات HbبهHiCNتبديل مي شوند.به استثنائ S Hb(سولفوهموگلوبين)

7. هماتوكريت(PVC): • پيش ازبرداشتن نمونه خون براي آزمايشات هماتولوژي ،هم زدن كامل نمونه بسياراهميت دارد. • هماتوكريت عبارت است از نسبت حجم اريتروسيتهابه حجم كل خون وبه صورت %بيان مي شود. • هماتوكريت خون وريدي باهماتوكريت خون مويرگي مطابقت داردوهردوي آنهابيشترازهماتوكريت توتال بدن هستند. • هپارين و(EDTA)ضدانعقادهاي مناسب براي هماتوكريت هستند. • هماتوكريت رامي توان بطورمستقيم به وسيله سانتريفوژ نمودن به روش ماكرويا ميكرو اندازه گيري نمودويابطور غيرمستقيم ازحاصلضرب MCVدرشمارش RBCمحاسبه نمودكه اينكاردردستگاههاي خودكارشمارشگرانجام مي شود. • چنانچه خون دردماي اتاق نگهداري شوددرفاصله 6تا24ساعت تورم اريتروسيتهاباعث بالارفتن MCVوHctمي شود.شمارش سلولي وانديسهادردماي 4درجه سانتيگرادبه مدت 24ساعت ثابت هستند. • روش ميكرو:

8. وسايل: • 1-لوله موئينه به طول تقريبا 7سانتي مترباقطرداخلي يك ميلي مترمورداستفاده قرارمي گيرد. • 2-خميرهماتوكريت • 3-سانتريفوژهماتوكريت • 4-خط كش • لوله بايدحداقل 5سانتيمترازخون پرشود. • سانتريفوژكردن در12000 -10000gبمدت 5دقيقه كافي است مگرآنكه Hctبيش از50%باشدكه دراينصورت براي اينكه حداقل به دام افتادگي پلاسمادرلابلاي گلبولهاايجادشودبهتراست 5دقيقه ديگراضافه شود. • Hctنشاندهنده غلظت گلبولهاي قرمزاست ونه كل توده گلبول قرمز. • درحاملگي به هيدرمي Hctكم مي شوددرحاليكه توده كل گلبولهاي قرمزجريان خون كاهش نيافته است. • درشوك همراه باغليظ شدن خون Hctممكن است نرمال وياحتي بالا باشد،درحاليكه توده گلبول قرمزممكن است دراثرازدست رفتن خون به حدقابل توجهي كاهش يافته باشد.

9. نتيجه هماتوكريت بلافاصله پس ازخونريزي وياترانسفوزيون براي ارزيابي آنمي قابل اعتمادنخواهدبود. • منابع خطا: • 1-سانتريفوژ • 2-نمونه • 3-خطاهاي انساني • زمان وسرعت كافي سانتريفوژ نمودن براي بدست آوردن يك Hctصحيح ضروري است. • باانجام سانتريفوژمقداركمي لكوسيت ،پلاكت وپلاسمادرلابلاي ستون گلبولهاي قرمزباقي مي ماند،خطاي ناشي ازاين مقداربي اهميت است. • درآنمي ماكروسيتيك،اسفروسيتوزوآنمي هاي هايپوكروميك مقدارپلاسماي به دام افتاده اندكي بيشتراست ودرآنمي سيكل سل اين مقداربازهم بيشترخواهدبود. • درمواردي كه دستگاههاي شمارشگربه وسيله روش ميكروهماتوكريت كاليبره مي شوند،توصيه مي شودتصحيح مربوط به پلاسماي به دام افتاده انجام شود.

10. وضعيت بيمار،فعاليت عضلاني وطولاني شدن زمان تورنيكت مي تواندباعث تغييردرHctشود. • ناكافي بودن نمونه خون براي مقدارثابتي از EDTAبه دليل چروكيده شدن سلولهاباعث كاهش كاذب Hctمي شودولي درميزان Hbوشمارش سلولهاتاثيرندارد. • خوب هم نزدن نمونه ،نادرست خواندن سطح سلولهاوپلاسماوبه شمارآوردن لايه بافيكوت جزئ اريتروسيتها ازجمله خطاهاي تكنيكي است. • درحالت مناسب دقت هماتوكريت باضريب تغييرات 2CV±برابر0.1است.درمقاديرهماتوكريت پايين به دليل خطاي درقرائت CVبالاترخواهدبود. • مشاهده ماكروسكوپي نمونه مي توانداطلاعات ارزشمندي به مابدهد. • شمارش سلولها • قبلابه دليل استفاده ازهموسيتومترتعدادسلولهادرميلي مترمكعب بيان مي شد(1ميليمترمكعب =ml1/00003(،امروزه كميته بين المللي استانداردسازي خونشناسي توصيه مي كندكه واحدحجم بصورت ليتربيان شود،بعنوان مثال

11. 500*10⁶/mm³=500*10⁶µl=500*10¹²/l=اريتروسيت ها • 70*10³/mm³=70*10³µl=7*10⁹/l=لكوسيت ها • 300*10³/mm³=300*10³µl=300*10⁹/l=پلاكت ها • شمارش اريتروسيتها: • دستگاههاي شمارشگراساس كارشان يابرپايه امپدانس الكتريكي است وياپراكنده شدن نور،درروش اول سلولهاازميان منفذي كه جريان الكتريكي ثابتي ازآن مي گذرد،عبوركرده وباعث تغييرمقاومت الكتريكي مي شوندونوسانات ولتاژايجادشده اندازه گيري مي شوند. • هرسلولي كه ازمنفذ عبورمي كندجايگزين هم حجم خودازمحلول ايزوتون مي شودوباعث افزايش مقومت شده ويك پالس ولتاژتوليد مي كند،پالسهاكه ارتفاع آنهاباحجم سلول متناسب است،شمارش مي شوند. • اگردويابيش ازدوسلول بطورهمزمان واردمنفذ شوندبه عنوان يك پالس شمارش خواهندشد،اين باعث خطاي كوانسيدانس مي شودكه بايدتصحيح گردد.دردستگاههاي جديداين خطابطورخودكارتصحيح مي شود. • درروش دوم نورتابيده شده ازمنبع نوري بروي فلوسل كه سلولهاازآن عبورمي كنند،متمركز مي شود.عبورهرسلول باعث پراكندگي نورمي گرددويك اشكاركننده حساس به نورميزان پراكنده شدن نوررااندازه گيري مي كند.اندازه پالس آشكارشده متناسب بااندازه ذرات موردنظر(WBC،RBC،پلاكت )خواهدبود.

12. دقت دستگاههايي كه ازهردوروش استفاده مي كنندباهم برابراست. • انديس هاي گلبول قرمز: • MCV:عبارتست ازحجم متوسط گلبول قرمزوبااستفاده از Hctوشمارش گلبول قرمزمحاسبه مي شود: MCV=Hct*1000/RBC • مثال: MCV=0.45*1000/5=90 • واحدMCVفمتوليتراست كه برابراست با1ميكرون مكعب وبرابراست با10¯¹⁵L. • MCH:عبارتست ازوزن متوسطHbيك گلبول قرمزوباكمك غلظت Hbوشمارش RBCمحاسبه مي شود: MCH=Hb(g/l)/RBC(m/l) • مثال: گرم30*10¯¹²=MCH=150/5*10¹² يا30پيكوگرم.واحدMCHپيكوگرم است كه برابر10¯¹²گرم مي باشد.

13. MCHC:عبارتست ازغلظت متوسط Hbدرحجم مشخصي ازگلبولهاي قرمزمتراكم .MCHCبااستفاده ازغلظت Hbودرصدهماتوكريت محاسبه شده وبرحسب gr/dlبيان مي شود. • MCHC=Hb/Hct • MCHC=15/0.45=33.3gr/dl • دردستگاههاي شمارشگرMCVباتوجه به ارتفاع متوسط پالسهاي ولتاژدرزمان شمارش RBCبه دست مي آيدوHctازرابطه زيرمحاسبه مي شود: • Hct=MCV*RBC • اگرپلاسماي به دام افتاده شده درروش ميكروهماتوكريت تصحيح شودمقاديرانديسهادرروشهاي دستي وخودكاردرموردافرادنرمال ،مشابه خواهدبود. • درآنمي هاي هيپوكروميك وسيكل سل به دليل افزايش پلاسماي به دام افتاده MCHCمحاسبه شده بااستفاده ازميكروهماتوكريت نسبت به دستگاههاي شمارشگربه شكل بارزي كاهش خواهدداشت . • درآنمي هاي ميكروسيتيك MCVممكن است تاحد50flوMCHتا15pgوMCHCتا22g/dlكاهش يابدولي بندرت ازاين حدكمترخواهدبود.

14. درآنمي هاي ماكروسيتيك MCVممكن است تا150وMCHتا50افزايش يابدولي MCHCطبيعي بوده وياكاهش دارد. • MCHCتنهادراسفروسيتوزافزايش داردوبندرت از 38g/dlفراترخواهدرفت. • شمارش گلبولهاي سفيد: • به دلايل زيريك تكنولوژيست بايدبتواندازروش هموسيتومتراستفاده نمايد: • 1-به منظورچك كردن صحت كارشمارشگروكاليبراسيون آن. • 2-به منظورچك كردن صحت كارشمارشگردربيماراني كه دچارلكوپني ياترومبوسيتوپني شديدهستند. • 3-درموردنمونه هايي كه منجربه تداخل درشمارش پلاكتهامي شوند(بطورمثال وجودRBCهاي بسيارميكروسيتيك). • 4-به عنوان روش Back up. • لام شمارش ولامل بايدبلافاصله پس ازاستفاده درآب نيم گرم آب كشي شده وبايك پاچه نرم بدون پرزخشك شود. • خون پس ازمخلوط كردن كامل به نسبت 1:20بامايع رقيق كننده رقيق مي شود.

15. مایع رقیق کننده اریتروسیتهارالیز می کندتامانعی برای شمارش لکوسیتهانباشند.مایع بایددریخچال نگهداری شده وگاهی صاف شودتاعاری ازمخمرهاوکپکهاشود. • محاسبه: • WBC=CC/1Sc *d*10 • دراین فرمول CCکل سلولهای سفیدشمارش شده،dفاکتوررقت،10فاکتورتبدیل کننده حجم به mm³(عمق بین لام ولامل) و1Scتعدادمربع های بزرگ شمارش شده است. • درلکوپنی های زیر2500خون بایدبه نسبت1:10ودرلکوسیتوزبه نسبت 1:100یا1:200رقیق شود. • منابع خطا: • 1-خطاهای ناشی ازنمونه • 2-“ ” ” ازاپراتور • 3- ” ” ” ازوسایل • 4-خطاهای ذاتی (Field errors) • خطای نمونه :وجودلخته های کوچک،خوب مخلوط نشدن نمونه

16. خطای اپراتور:خطادرهنگام رقیق کردن،پرکردن هموسیتومترشمارش. • خطای وسایل:وسایل مورداستفاده بایداستانداردوسالم باشند. • Field errors:حتی دربهترین شرایط ورعایت تمام نکات،تغییراتی درشمارش سلولهایی که دریک حجم مشخص توزیع شده اندبه چشم می خورد.این خطاFeild errorنامیده می شود.هرچه سلولهای بیشتری راشمارش کنیم این خطاکمترمی شود. • شمارش سفیدبااستفاده ازهموسیتومتردرشمارش های نرمال وافزایش یافته CVبرابر6/5%ودرلکوپنی CV=15%ایجادمی کند.دردستگاههای شمارشگرخودکارCV=1-3%است. • تصحیح شمارش WBC:اگردربررسی اسمیررنگ شده متوجه شدیم که شمارش NRBCبالااست،بایدبااستفاده ازفرمول زیرتصحیح انجام شود: • WBC=WBC(count)*100/100+NRBC • بطورمثال اگرشمارش WBC=10000وتعدادNRBC=25(ضمن شمارش 100گلبول سفید)باشد: • WBC(Fact)=10000*100/100+25 =8000=8*10⁹/l

17. شمارشگرهای الکترونیک:سرعت انجام کار،حذف خستگی تکنیسین وافزایش دقت ازمزایای این روش هستند. • شمارش پلاکت: • پلاکتهادیسکهایی به قطرμ4-2وحجمfl 7-5هستند(درخون سیتراته)آنهادرهموستاز،سلامت عروق وروندانعقادخون نقش دارند.میزان طبیعی شمارش پلاکت 150-450*10⁹/lاست. • درخون دارای EDTAحجم متوسط پلاکت(MPV)تایکساعت افزایش می یابدسپس درفاصله 3-1ساعت نسبتاثابت است وسپس باگذشت زمان افزایش می یابد. • تغییرشکل ازفرم دیسکی به کروی دلیل افزایش حجم واضح درخون حاوی EDTAنسبت به خون سیتراته است. • برای بدست آوردن نتایج قابل تکرارحجم پلاکت بایددرفاصله1تا3ساعت پس ازخونگیری اندازه گیری شود. • مقدارطبیعی برای MPVدربالغین تقریبا6.5-12flاست. • درافرادنرمال یک رابطه معکوس بین MPVوشمارش پلاکت وجوددارد. • MPVدرهیپوتیروئیدیسم وبیماریهای میلوپرولیفراتیوافزایش می یابد.

18. شمارش پلاکت بسیارمشکل است زیراآنهاکوچک بوده وبایدازذرات آشغال تشخیص داده شوند.همچنین آنهاتمایل دارندبه شیشه یاسطوح خارجی دیگروبویژه به یکدیگر بچسبند. • درصورت استفاده ازخون مویرگی گسترش بایدبلافاصله پس ازگرفتن خون تهیه شودتاازبهم چسبیدن پلاکتهاوکاهش آنهادراثرچسبیدن به حاشیه رگ آسیب دیده جلوگیری شود. • استفاده ازخون وریدی گرفته شده روی EDTAمناسب تراست،زیراپلاکتهابطوریکنواخت پراکنده شده وتجمع کمترصورت می گیرد. • روش چشمی انتخابی برای شمارش پلاکت استفاده ازمیکروسکوپ فازکنتراست است .این روش مرجع می باشد.

19. برگرفته شده از اسلايدهاي آقاي دكتر سليماني مسئول آزمايشگاه تربت حيدريه