Journal Club um exemplo para começar

1. Journal Club um exemplo para começar ruifonte@med.up.pt Departamento de Bioquímica da Faculdade de Medicina do Porto

2. Este paper é um marco histórico na Medicina e na Bioquímica. Cori, G. T. & Cori, C. F. (1952) Glucose-6-phosphatase of the liver in glycogen storage disease, J Biol Chem. 199, 661-7. Foi a primeira vez que se conseguiu provar uma hipótese que havia sido formulada no início do século XX: que algumas doenças congénitas poderiam ter como causa o défice de uma enzima. O trabalho foi feito por dois investigadores que tinham ganho o prémio Nobel da medicina em 1947.

3. Em 1952, já se conhecia a via de degradação do glicogénio. A via de síntese só foi descoberta no final dessa década (por Luis Leloir em 1959). Glicose-6-fosfátase Fosforílase do glicogénio Fosfoglicomútase H2O Enzima desramificante

4. Alguns doentes tinham acumulação de glicogénio no fígado e episódios de hipoglicemia e porque, em 1929, von Gierke tinha descrito os achados morfológicos em doentes com estas características a doença (de facto um síndrome a que correspondem várias doenças) tinha sido designada de “doença de von Gierke”. Com base no que se conhecia sobre o metabolismo do glicogénio, Cori e Cori formularam hipóteses acerca da patogenia da doença de von Gierke e testaram essas hipóteses. De acordo com o que se conhecia na época que hipóteses seriam plausíveis? Será que o defeito está na glicose-6-fosfátase? Como testar esta hipótese? 1- Colheram amostras de fígado em indivíduos normais, em doentes com patologias hepáticas não relacionadas e com “doença de von Gierke”. 2- Prepararam homogeneizados de fígado a partir dessas amostras. 3- Mediram a atividade da enzima suspeita nesses homogeneizados. 4- Compararam os resultados obtidos com as diferentes amostras. 5- Procuraram interpretar os resultados. 6- Com base nesses resultados, formularam novas hipóteses e testaram-nas.

5. Método geral usado para medir a glicose-6-fosfátase. A atividade da enzima foi calculada subtraindo os valores de Pi formado em ensaios gémeos que não incluíam o substrato. Biopsia hepática Homogeneizado de fígado G6P Reagente que desnatura a enzima e reage com o Pipermitindo o seu doseamento

6. Meio de ensaio: Volume = 1 mLTampão = citrato 30 mM, pH 6.8Homogeneizado hepático equivalente a 4 a 33 mg de fígado.Substrato = glicose-6-fosfato 5 mMTemperatura = 30ºCTempo de ensaio = 1 horaPararam a reação com ácido tricloroacético, filtraram e dosearam a Pi formado.Expressaram os resultados em Pi formado por 100 mg de fígado. Que doentes tinham, claramente valores muito baixos de glicose-6-fosfátase? A análise do glicogénio de CH mostrou que era anormal: demasiado ramificado. Porque é que o resultado de CH era algo mais baixo que o normal?

7. Perguntas? 1- Dando-se a coincidência de 2 dos 3 resultados com valores muito baixos corresponderem a material de autópsia poderia isto querer dizer que a glicose-6-fosfátase sofreu degradação após a morte dos pacientes MAS e PS? Os dados pareciam negar esta hipótese…que dados? 2- Será que o fígado de MAS continha um inibidor que impedia a ação catalítica da glicose-6-fosfátase? Testaram e os dados obtidos também pareciam negar esta hipótese. Que dados? 3- Será a glicose-6-fosfátase era normal mas faltava uma substância não enzímica no fígado de MAS e PS que era essencial à atividade da enzima? Ferveram fígado de CS… e os dados obtidos também pareciam negar esta hipótese. Que dados?

8. 4- Será que o défice poderia ser na fosfoglicomútase (e não na glicose-6-fosfátase) ? Para testar essa hipótese substituíram a glicose-6-P por glicose-1-P no meio de ensaio e voltaram a ensaiar a formação de Pi. No caso MAS: baixo Pi formado nos dois ensaios, acumulação de glicose-6-P quando se usou glicose-1-P como substrato. No caso CS (controlo): alta produção de Pi nos dois ensaios e nãoocorreu acumulação de glicose-6-P quando se usou glicose-1-P como substrato. Serão estes dados compatíveis com défice de fosfoglicomútase? 5- Também se testaram as atividades de duas enzimas conhecidas como fosfátase ácida e alcalina. Usaram como substrato glicerofosfato e pH 5 no primeiro caso e pH 9 no segundo. Serão estes dados compatíveis com défice de fosfátase ácida ou com défice de fosfátase alcalina?