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第十章　 DNA 的复制和修复

第十章　 DNA 的复制和修复. 第一节　半保留复制 第二节　参与 DNA 复制的酶与蛋白质 第三节　复制过程 第四节　 DNA 损伤及修复. 一、概念. 以 亲代 DNA 双链 为模板以 碱基互补 方式合成子代 DNA， 这样新形成的子代 DNA 中，一条链来自亲代 DNA， 而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫 半保留复制 。. 几个相关概念： 1. 复制起始点 (origin, ori) 原核生物只有一个复制起始点； 真核生物染色体 DNA 有多个复制起始 点，同时形成多个复制单位， 两个起始点

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第十章　 DNA 的复制和修复

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Presentation Transcript

  1. 第十章　DNA的复制和修复

  2. 第一节　半保留复制 第二节　参与DNA复制的酶与蛋白质 第三节　复制过程 第四节　DNA损伤及修复

  3. 一、概念 以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。

  4. 几个相关概念： 1. 复制起始点(origin, ori) 原核生物只有一个复制起始点； 真核生物染色体DNA有多个复制起始 点，同时形成多个复制单位， 两个起始点 之间的DNA片段称为复制子(replicon)。

  5. 复制子

  6. 2. 复制叉(replication fork) 复制时双链打开，分开成两股，新链沿 着张开的模板生成，复制中形成的这种Y 字形的结构称为复制叉。

  7. 二、实验依据

  8. 起始点 起始点 起始点 未复制DNA 起始点 　　　　复制叉 　　　　的推进 单向复制 复制叉 双向复制 环状DNA复制时所形成的Q结构 复制叉 复制叉 三、DNA复制的起点和方向

  9. B    A        B      C   C     环状DNA的复制 A 复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims实验)

  10. 四、复制特点 　半不连续复制 　半保留复制

  11. 解旋酶 解链酶 引发体 SSB RNA引物 DNA聚合酶III DNA聚合酶I 随后链 3´ 3´ 3´ 5´ 前导链 RNA引物 5´ 3´ 复制叉的移动方向 复制特点 DNA的半不连续复制复制过程 复制的起始 DNA链的延长 DNA链终止 3´ 5´

  12. 第二节　参与DNA复制的酶与蛋白质★

  13. 　　复制相关蛋白的基因：dna A、dna B、dna C… …dna X 　　相应的表达产物蛋白质：Dna A、Dna B、Dna C … …Dna X Dna A：辨认复制起始位点 Dna B：解螺旋酶 Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上 结 合并打开双链。

  14. 一、DNA聚合酶★ （一）催化的反应特点★ 以四种dNTP为原料 　　需要模板 　　需要引物　 　　催化反应方向为5’-3’ 　产物性质与模板链相同

  15. （二）大肠杆菌三种DNA聚合酶比较 DNA 聚合酶Ⅰ DNA 聚合酶Ⅱ DNA 聚合酶 比较项目 109，000 400 + + + 1 400，000 10-20 + + - 50 分子量 每个细胞的分子统计数 5´-3 ´聚合酶作用 3´-5 ´核酸外切酶作用 5´-3 ´核酸外切酶作用 转化率 120，000 100 + + - 0 .05 复制 切除引物 修复 功能 修复 1999年发现聚合酶 和，它们涉及DNA的错误倾向修复（errooune repair）

  16. DNA聚合酶 I （1）5  3 聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）； （2）3  5’外切酶活性（在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链，只作用于生长中不配对的单链，校对功能。）； （3）还具有5 3’外切酶活性（双链有效）；

  17. 5  3 聚合酶功能 (dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi

  18. 聚合反应机理：

  19. 3´- 5´核酸外切酶水解位点 DNA聚合酶3´- 5´外切酶活力 DNA聚合酶的3´- 5´外切酶水解位点 5´ 3´ 切除引物、 切除突变的片段

  20. DNA聚合酶5´- 3´外切酶活力 5´ 单链缺口 5´- 3´核酸外切酶水解位点 切除错配的核苷酸

  21. DNA-pol I: 曾被称为复制酶(replicase) 含量最多 可被水解成两个片段 小片段(N端)：具有5´→3´外切酶活性； 大片段(C端)：具有聚合活性和3´→5´ 外切酶活性，也称为Klenow片段，是常用的工具酶。

  22. DNA-pol III: • 由10种亚基组成的不对称聚合体 • 催化效率最高

  23.         DNA聚合酶Ⅲ 两个亚基夹住DNA DNA聚合酶Ⅲ异二聚体 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能 核心酶 引物的结合和识别 校对 促使核心酶二聚化 延长因子

  24. DNA聚合酶Ⅲ全酶的亚基组成

  25. Arthur Kornberg 1918 Stanford University Stanford, CA, USA The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959 "for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid"

  26. 拓扑异构酶： 催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶， 在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。 二、解旋酶（解超螺旋，也叫拓扑异构酶、DnaB蛋白）

  27. 拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。 拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。 拓扑异构酶Π：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。

  28. DNA的超螺旋结构（原核） 二级结构为闭环双螺旋；三级结构为超螺旋

  29. ①连环数（linking number , L） DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数 ②扭转数（twisting number , T） DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示 ③超螺旋数（缠绕数 , writhing number , W） L=T+W

  30. 三、解链酶（ DnaA蛋白） 四、SSB 五、引物酶 六、DNA连接酶

  31. 解螺旋/链　酶 (helicase)（ DnaA蛋白）: 　模板对复制的指导作用在于碱基的准确 配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋 白质，当时称为rep蛋白。作用是利用ATP供 能，解开DNA双链。

  32. 四、SSB SSB曾被称为螺旋反稳定蛋白（HDP）。 SSB与解开的DNA单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复制中维持模板处于单链状态。

  33. 引物酶 (primase): • 依赖DNA的RNA聚合酶。 • 催化RNA引物的合成。 • 在大肠杆菌，引物酶是dna G基因的产物。 RNA引物： 　　在DNA模板的复制起始部位由引物酶催 化NTP的聚合，形成短片段的RNA，为DNA 聚合提供3´-OH末端。

  34. ATP或NAD＋ AMP+PPi或NMN+AMP 5' 3' 模板链 连接酶连接切口 A G T G A A C C T T C T G G T A A C 5' 3' P P P P P P P P P OH 缺口 连接酶 Mg2+ 3' 5' 模板链 A G T G A A C C T T C T G G T A A C P P P P P P P P P 5' 3'

  35. 大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。 DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。

  36. 第三节　复制过程 一、复制起始 二、链的延长（冈崎片段的合成） 三、复制的终止

  37. 一、复制起始 1、拓扑异构酶解开超螺旋。 2、Dna A蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。 3、在类组蛋白（HU、ATP参与下, Dan A蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。 4 、Dna B借助于水解ATP产生的能量在Dna C的帮助下沿5’→3’ 方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。 5、单链结合蛋白结合于单链。 6、引物合成酶（Dna G蛋白）开始合成RNA引物。 起始复合物 开链复合物 前引发复合物

  38. 引发体 (primosome): • 是由Dna B、Dna A、Dna C以及其他复制 因子一起形成复合体，再结合引物酶形成 较大的聚合体，结合到模板DNA上。

  39. 二、链的延长（冈崎片段的合成） • 真核生物的冈崎片段为：100-200bp • 原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp

  40. 冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:

  41. 引导链与随从链分别由哪些酶或蛋白参与？

  42. oric 三、复制的终止 复制叉1 复制叉2 复制叉1 复制叉2 连锁染色体 完成复制 DNA拓扑异构酶 终止复制叉2 终止复制叉1

  43. DNA忠实性的保障 1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/104～1/105。 2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低100～1000倍。 3、复制中的即时校读功能。

  44. 真核细胞内有五种DNA聚合酶

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