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ENZIMI DI RESTRIZIONE

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ENZIMI DI RESTRIZIONE. Reazione ligasica di frammenti di restrizione. DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI. CLONAGGIO

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
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Reazione

ligasica di

frammenti di

restrizione

slide3

DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO

UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA

LIGASI

CLONAGGIO

-IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN

INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO

GENETICAMENTE IDENTICI

-IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICA

OTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA

DI PARTENZA

slide4

Vettori e clonaggio

Vettori

Plasmidi

Fagi

Cosmidi

YAC

slide5

Vettori e clonaggio

Plasmide

Molecola circolare di DNA a doppio

filamento, normalmente presente

nella cellula batterica, in grado

di replicarsi autonomamente

dal cromosoma.

slide8

Bromo-chloro-indoyl--galactopyranosidase or X-Gal (Clear)

-galactosidase

Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble)

+

galactose

bacteria from ligation plated on ampicillin and x gal
Bacteria from ligation platedon ampicillin and X-Gal

Contains

wild type

plasmd

Contains

recombinant

plasmd

slide10

Vettori e clonaggio

Lunghezza massima del

DNA clonabile in un plasmide:

circa 20 Kb

slide11

Vettori e clonaggio

I virus sono piccoli parassiti

non in grado di replicarsi.

Dopo aver infettato una

cellula-ospite utilizzano i suoi

sistemi di replicazione e sintesi

delle proteine per riprodursi

slide12

Vettori e clonaggio

I batteriofagi (o fagi) sono virus

che infettano i batteri.

slide13

Vettori e clonaggio

Il fago più utilizzato in biologia

molecolare è il fago 

slide14

Vettori e clonaggio

Assemblaggio

di un fago 

slide15

Vettori e clonaggio

Mappa del genoma del fago 

slide16

Vettori e clonaggio

Clonaggio di

frammenti di

DNA nel

fago 

slide17

Vettori e clonaggio

Formazione di cloni fagici

slide18

Vettori e clonaggio

L’infezione dei batteri con il fago 

è circa 103 volte più efficiente

della trasformazione

con un plasmide

slide19

Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA

clonabile in un fago:

20-25 Kb

slide20

Vettori e clonaggio

Un cosmide è un plasmide

contenente la sequenza COS

dal fago 

slide22

Vettori e clonaggio

Clonaggio di

frammenti di

DNA in un

cosmide

slide23

Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA

clonabile in un cosmide:

circa 45 Kb

slide24

EcoR I

Infect cells

Genomic Library

slide25

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

cDNA synthesis

AAAAAA

AAAAAA

Infect cells

cDNA library

genomic library construction
Genomic Library Construction
  • Preparing the insert
    • Partial digestion preferred
slide27

Purpose

Probe

Source

Type

Variation

Representation

Insert size

Genomic DNA

Species or strains

Equal

12k -- 20k

DNA

Gene structure

Infer protein identity

Only one

Encoded protein

Infer protein identity

Correlate with

expression level

Species or strains

Tissues

Developmental stages

Expression vs. non

expression

mRNA

DNA or antibody or

protein

0.2k -- 6k

Genomic library

cDNA library

screening with dna probe
Screening with DNA probe
  • Probe is identified cloned
    • From other organism
    • Same organism
      • Looking for variants
      • Chromosome walk

Chromosome walk

genome projects
Genome Projects
  • Whole genome sequencing
  • Fragment and clone
  • Sequence ALL clones!
  • Computer assembles
genome projects1

Bee

Cat

Chicken

Cow

Dog

Fruit fly

Human

Malaria parasite

Microbial Genomes

Mosquito

Mouse

Nematode

Pig

Plant Genomes Central

Rat

Retroviruses

Sea urchin

Tribolium

Sheep

Zebrafish

Genome Projects
  • Multiple organisms provide suitable systems for experimentation
    • Zebrafish-development
    • Rat-physiology
    • Dog- genetic disease
    • Fruit fly- behavior
  • Some of practical significance
    • Mosquito/Malaria parasite
slide31

Il metodo Sanger

  • (o metodo a terminazione di catena)

Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad

1) Uno stampo a singola elica

2) un innesco specifico (primer)

3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S

ha bisogno di:

4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

slide32

Terminazione della catena

La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue

indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro

distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi

trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

slide33

Schema di sequenziamento a terminazione di catena

3’-GGCTAAC

3’-GGCTAAC

5’

3’

DNA stampo a

singola elica

Ibridazione con

Il primer

+

[35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi

ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP

-CCG ddA

-ddC

-CC ddG

-CCGA ddT

-C ddC

-CCGATT ddG

-CCGAT ddT

A C G T

-CCGATT ddG

-CCGAT ddT

-CCGA ddT

-CCG ddA

-CC ddG

-C ddC

-ddC

G

T

T

A

G

C

Direzione di

lettura

C

Sequenza: 5’-CCGATTG

slide34

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Coniugando a ciascun ddNTP

un diverso marcatore fluorescente, è

possibile effettuare le quattro reazioni di

sequenziamento in un unico tubo da saggio

e caricare il tutto in solo pozzetto di gel

ddA

ddT

ddC

ddG

slide35

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le

informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore

diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

slide36

AGTACTG G GATC

Gel

Electrophoresis

Fluorescent DNA Sequencing

slide37

Detection of Fluorescently Tagged DNA

Optical

Detection System

Scanning Laser

Excites

Fluorescent Dyes

Output to Computer

DNA Fragments

Separated by

Electrophoresis

size of gene library
Size of gene library

N = ln(1-P)

ln (1-A/B)

N = Number of clones

P = 95 % probability of finding gene

A = Average size of DNA fragments

B = Total size of genome

E. coli has genome of 4,800,000 nucleotides

Average size of insert is 10,000 nucleotides

Number of clones for 95 % probability is 1700

size of gene library1
Size of gene library
  • If genome is large e.g. human genome (3 x 109) then number of clones to make library becomes unrealistic (1058000) if using a plasmid vector (accepts only 10 kb as larger DNA can’t be transformed)
  • Therefore need to use vectors that can accept larger pieces of DNA
    • I.e. if each vector contains a large piece of DNA you don’t need so many clones to make a gene library
what vectors for what libraries
What vectors for what libraries?

Human library requires >1,000,000 plasmid clones

Human library requires 14000 YAC clones

slide43

Vettori e clonaggio

YAC=yeast artificial chromosome

slide45

Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA

clonabile in uno YAC:

fino a 1000 Kb

slide46

Vector Type

Cloned DNA (kb)

Vettori e clonaggio

Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors

20

Plasmid

25

λ phage

45

Cosmid

100

P1 phage

300

BAC (bacterial artificial chromosome)

1000

YAC (yeast artificial chromosome)

whole genome shotgun

Fragment and sequence entire genome

Whole Genome Shotgun
  • Celera Genomics

Each fragment is sequenced completely and then these pieces are aligned to one another by a computer, based on overlapping sequence between fragments.

overview of facts asserted
Overview of Facts Asserted
  • 2.91 billion base pairs (bp)
  • 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA
  • 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s)
  • less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins