ENZIMI DI RESTRIZIONE
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ENZIMI DI RESTRIZIONE. Reazione ligasica di frammenti di restrizione. DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI. CLONAGGIO

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Presentation Transcript


ENZIMI DI RESTRIZIONE


Reazione

ligasica di

frammenti di

restrizione


DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO

UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA

LIGASI

CLONAGGIO

-IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN

INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO

GENETICAMENTE IDENTICI

-IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICA

OTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA

DI PARTENZA


Vettori e clonaggio

Vettori

Plasmidi

Fagi

Cosmidi

YAC


Vettori e clonaggio

Plasmide

Molecola circolare di DNA a doppio

filamento, normalmente presente

nella cellula batterica, in grado

di replicarsi autonomamente

dal cromosoma.


VETTORI DI CLONAGGIO


Bromo-chloro-indoyl--galactopyranosidase or X-Gal (Clear)

-galactosidase

Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble)

+

galactose


Bacteria from ligation platedon ampicillin and X-Gal

Contains

wild type

plasmd

Contains

recombinant

plasmd


Vettori e clonaggio

Lunghezza massima del

DNA clonabile in un plasmide:

circa 20 Kb


Vettori e clonaggio

I virus sono piccoli parassiti

non in grado di replicarsi.

Dopo aver infettato una

cellula-ospite utilizzano i suoi

sistemi di replicazione e sintesi

delle proteine per riprodursi


Vettori e clonaggio

I batteriofagi (o fagi) sono virus

che infettano i batteri.


Vettori e clonaggio

Il fago più utilizzato in biologia

molecolare è il fago 


Vettori e clonaggio

Assemblaggio

di un fago 


Vettori e clonaggio

Mappa del genoma del fago 


Vettori e clonaggio

Clonaggio di

frammenti di

DNA nel

fago 


Vettori e clonaggio

Formazione di cloni fagici


Vettori e clonaggio

L’infezione dei batteri con il fago 

è circa 103 volte più efficiente

della trasformazione

con un plasmide


Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA

clonabile in un fago:

20-25 Kb


Vettori e clonaggio

Un cosmide è un plasmide

contenente la sequenza COS

dal fago 


Vettori e clonaggio


Vettori e clonaggio

Clonaggio di

frammenti di

DNA in un

cosmide


Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA

clonabile in un cosmide:

circa 45 Kb


EcoR I

Infect cells

Genomic Library


AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

cDNA synthesis

AAAAAA

AAAAAA

Infect cells

cDNA library


Genomic Library Construction

  • Preparing the insert

    • Partial digestion preferred


Purpose

Probe

Source

Type

Variation

Representation

Insert size

Genomic DNA

Species or strains

Equal

12k -- 20k

DNA

Gene structure

Infer protein identity

Only one

Encoded protein

Infer protein identity

Correlate with

expression level

Species or strains

Tissues

Developmental stages

Expression vs. non

expression

mRNA

DNA or antibody or

protein

0.2k -- 6k

Genomic library

cDNA library


Screening with DNA probe

  • Probe is identified cloned

    • From other organism

    • Same organism

      • Looking for variants

      • Chromosome walk

Chromosome walk


Genome Projects

  • Whole genome sequencing

  • Fragment and clone

  • Sequence ALL clones!

  • Computer assembles


Bee

Cat

Chicken

Cow

Dog

Fruit fly

Human

Malaria parasite

Microbial Genomes

Mosquito

Mouse

Nematode

Pig

Plant Genomes Central

Rat

Retroviruses

Sea urchin

Tribolium

Sheep

Zebrafish

Genome Projects

  • Multiple organisms provide suitable systems for experimentation

    • Zebrafish-development

    • Rat-physiology

    • Dog- genetic disease

    • Fruit fly- behavior

  • Some of practical significance

    • Mosquito/Malaria parasite


  • Il metodo Sanger

  • (o metodo a terminazione di catena)

Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad

1) Uno stampo a singola elica

2) un innesco specifico (primer)

3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S

ha bisogno di:

4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza


Terminazione della catena

La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue

indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro

distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi

trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’


Schema di sequenziamento a terminazione di catena

3’-GGCTAAC

3’-GGCTAAC

5’

3’

DNA stampo a

singola elica

Ibridazione con

Il primer

+

[35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi

ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP

-CCG ddA

-ddC

-CC ddG

-CCGA ddT

-C ddC

-CCGATT ddG

-CCGAT ddT

A C G T

-CCGATT ddG

-CCGAT ddT

-CCGA ddT

-CCG ddA

-CC ddG

-C ddC

-ddC

G

T

T

A

G

C

Direzione di

lettura

C

Sequenza: 5’-CCGATTG


Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Coniugando a ciascun ddNTP

un diverso marcatore fluorescente, è

possibile effettuare le quattro reazioni di

sequenziamento in un unico tubo da saggio

e caricare il tutto in solo pozzetto di gel

ddA

ddT

ddC

ddG


Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le

informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore

diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.


AGTACTG G GATC

Gel

Electrophoresis

Fluorescent DNA Sequencing


Detection of Fluorescently Tagged DNA

Optical

Detection System

Scanning Laser

Excites

Fluorescent Dyes

Output to Computer

DNA Fragments

Separated by

Electrophoresis


Fluorescent DNA Sequencing Data


Fluorescent DNA Sequence Trace


Size of gene library

N = ln(1-P)

ln (1-A/B)

N = Number of clones

P = 95 % probability of finding gene

A = Average size of DNA fragments

B = Total size of genome

E. coli has genome of 4,800,000 nucleotides

Average size of insert is 10,000 nucleotides

Number of clones for 95 % probability is 1700


Size of gene library

  • If genome is large e.g. human genome (3 x 109) then number of clones to make library becomes unrealistic (1058000) if using a plasmid vector (accepts only 10 kb as larger DNA can’t be transformed)

  • Therefore need to use vectors that can accept larger pieces of DNA

    • I.e. if each vector contains a large piece of DNA you don’t need so many clones to make a gene library


What vectors for what libraries?

Human library requires >1,000,000 plasmid clones

Human library requires 14000 YAC clones


Vettori e clonaggio

YAC=yeast artificial chromosome


Vettori e clonaggio


Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA

clonabile in uno YAC:

fino a 1000 Kb


Vector Type

Cloned DNA (kb)

Vettori e clonaggio

Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors

20

Plasmid

25

λ phage

45

Cosmid

100

P1 phage

300

BAC (bacterial artificial chromosome)

1000

YAC (yeast artificial chromosome)


Fragment and sequence entire genome

Whole Genome Shotgun

  • Celera Genomics

Each fragment is sequenced completely and then these pieces are aligned to one another by a computer, based on overlapping sequence between fragments.


Overview of Facts Asserted

  • 2.91 billion base pairs (bp)

  • 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA

  • 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s)

  • less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins


Structure of the genome


http://genome.ucsc.edu


http://www.ncbi.nlm.nih.gov


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