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U niversidad de C arabobo Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Medicina“Dr . Witremundo T orrealba" Departamento de Fisiología y Bioquímica. Tema 3 Técnicas en Bioquímica Electroforesis. Br. Pérez José Br. Pérez Eleanny Br. Pérez Ana. Marzo, 2012.

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Tema 3 Técnicas en Bioquímica Electroforesis

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Presentation Transcript


Universidad de CaraboboFacultad de Ciencias de la SaludEscuela de Medicina“Dr. WitremundoTorrealba" Departamento de Fisiología y Bioquímica

Tema 3

Técnicas en Bioquímica

Electroforesis

Br. Pérez José

Br. Pérez Eleanny

Br. Pérez Ana

Marzo, 2012


Objetivos Específicos

  • Analizar los fundamentos teóricos de la electroforesis y su utilidad.


Contenido

  • Movimiento iónico en un campo eléctrico.

  • Proceso electroforético.

  • Cámara electroforética.

  • Materiales de soporte.

  • Utilidad de cada una de ella:

    • Electroforesis en geles de acrilamida.

    • Electroforesis en geles de acrilamida SDS.

    • Electroforesis bidimensional.

    • Electroforesis en geles de agarosa.


Electroforesis

Es una técnica para la

separación demoléculas

según la movilidad de

estas en un campo

eléctrico


Desventajas

Afecta la estructura de las proteínas por lo tanto, también afecta a la función de la misma.


Ventajas

  • Separación, visualización y cuantificación del numero de proteínas de una solución.


  • Movimiento iónico en un campo

  • electromagnético.

Las moléculas de soluto con carga neta positiva se desplazan hacia el cátodo y las moléculas con carga neta negativa se desplazan hacia el ánodo.

http://www.micruxfluidic.com/es/tecnologia.html


  • Movimiento iónico en un campo electromagnético.

  • La movilidad μ expresada en cm2 por Volt-s de una molécula en un campo eléctrico, viene dada por la velocidad de emigración V expresada en cm/s, respecto de la fuerza del campo E, expresada en voltios/cm.

  • La movilidad depende de la carga de la partícula que, a su vez, depende del pH del medio en el que se encuentre. Por esta razón es necesario indicar el electrolito o el pH utilizado para determinar la movilidad.


Proceso electroforético

En la electroforesis libre una disolución tamponada de la mezcla de proteínas se coloca en una célula de observación en forma de U mayúscula, depositando una capa de tampón (buffer) puro sobre la disolución de proteínas.


  • Unidades Horizontales:

  • Unidades Horizontales:

Cámaras electroforéticas.


Tipos de electroforesis


  • Electroforesis de frente móvil

Es aquella en la cual las partículas se mueven de forma libre en el medio en que se encuentran dispersas.


  • ELECTROFORESIS DE ZONA

La muestra esta obligada a desplazarse sobre un soporte solido tal como el papel o ciertos geles.


  • ¿Qué se necesita para realizar

  • una electroforesis de zona?


  • FACTORES QUE EFECTAN LA ELECTROFORESIS


CARGA NETA

TAMAÑO Y FORMA

POTENCIAL DEL CAMPO ELÈCTRICO


  • MECANISMOS DE SOPORTE


NO RESTRICTIVOS


ELECTROFORESIS CON PAPEL

ELECTROFORESIS CON AGAROSA


RESTRICTIVOS


ELECTROFORESIS DE POLIACRILAMIDA


Electroforesis en geles de acrilamida

Proteínas presentes en el extracto celular

  • Son químicamente inertes.

  • Son transparentes

  • Son estables en un amplio intervalo de valores de pH, temperatura y fuerza iónica

  • Son resistentes a los agentes desnaturalizantes.

  • Pueden prepararse con tamaños de poro muy variados.

Enzima RNA polimerasa de la bacteria E coli

Lehninger Principios de Bioquímica 4ta Edición


Electroforesis en geles de acrilamida SDS

  • Compuesto de gran carga negativa.

  • Utilizado para estimar la pureza y la masa molecular.

  • Se une a las proteínas en una cantidad proporcional a la masa molecular.

  • Confiere a todas las proteínas un cociente Carga/Masa similar.

Lehninger Principios de Bioquímica 4ta Edición


SDS - PAGE

  • Separa a las proteínas casi exclusivamente en función de su masa molecular

Lehninger Principios de Bioquímica 4ta Edición


Electroforesis bidimensional

Es la combinación secuencial del enfoque isoeléctrico y la electroforesis en gel con SDS.

SDS - PAGE

Lehninger Principios de Bioquímica 4ta Edición


Electroforesis en geles de Agarosa

Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma.


Resumen

  • Los procedimientos de fraccionamiento se usan para purificar las proteínas sobre la base de sus solubilidades, cargas, tamaños y especificidades de unión.

  • La electroforesis separa las moléculas según su tamaño y su carga.

  • La SDS-PAGE las separa principalmente por su tamaño.

  • La electroforesis en gel con SDS y el Enfoque Isoeléctrico se pueden utilizar por separado o combinados para obtener una mayor resolución.

  • La electroforesis bidimensional (2D) puede separar cientos de proteínas.


Bibliografía

  • http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-GELES%20AGAROSA.pdf

  • http://idibam.blogspot.com/2008/09/electroforesis-en-gel-de-agarosa.html

  • Lehninger. Principios de bioquímica Cuarta Edición.

  • Harold A .Harper .Manual de química Fisiológica Sexta Edición.

  • Biochemistry (3rd Edition) by Christopher K. MathewsKensal E. van Holde Kevin G. Ahern


Las grandes obras no son hechas con la fuerza, sino con la perseverancia.


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