第四章： DNA 纯化后的利用

1. 第四章：DNA纯化后的利用 在基因克隆实验中，一旦纯净DNA样品被制备出来，接下来的一步就是重组DNA分子的构建。为了得到重组分子，载体分子和将要被克隆的DNA都必须在特定的位点被切开并以可控的方式连接一起。切开和连接是DNA操作的两个基本技术。除了切开和连接外，DNA分子还能够被切短、延长，或被转录、复制，或通过添加和去除一些化学基团而被修饰。所有这些操作能够在试管中进行。

2. 几乎所有的DNA操作技术都需要使用纯净的酶。在细胞中，这些酶参与诸如DNA复制和转录，多余的或外来的DNA的降解，突变的修复，以及DNA重组等过程。从细胞提取物中纯化后，很多这样的酶能够在人工条件下催化其天然反应，或非常类似的反应。尽管这些反应都是直接的，但界大多数无法用化学方法实现。因此，纯化的酶对于基因工程是非常关键的，同时，其制备、性质的研究和市场买卖已经形成了一个重要的产业。几乎所有的DNA操作技术都需要使用纯净的酶。在细胞中，这些酶参与诸如DNA复制和转录，多余的或外来的DNA的降解，突变的修复，以及DNA重组等过程。从细胞提取物中纯化后，很多这样的酶能够在人工条件下催化其天然反应，或非常类似的反应。尽管这些反应都是直接的，但界大多数无法用化学方法实现。因此，纯化的酶对于基因工程是非常关键的，同时，其制备、性质的研究和市场买卖已经形成了一个重要的产业。

3. 4.1 DNA操作酶的种类 DNA操作酶根据其催化的反应可以分为5大类： （1）核酸酶（nucleases），切开或降解核酸分子。 （2）连接酶（ligases），将核酸分子连接起来。 （3）聚合酶（polymerases），复制核酸分子的酶。 （4）修饰酶（modifying enzyme），去除或添加化学基团的酶。 （5）拓扑异构酶（topoisomerases），向共价闭合环状DNA分子中引入或消除超螺旋。

4. 4.1.1 核酸酶 核酸酶通过打断DNA分子中相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键来水解DNA分子。它们可以分为两类： （1）外切核酸酶，从DNA分子的末端一个一个地切除核苷酸。 （2）内切核酸酶，从DNA分子内部打断磷酸二酯键。而内切酶可以在多核苷酸链内的不同位置水解磷酸二酯键。

5. 外切核酸酶又分为两种，一种能够从双链DNA分子的两条链上同时切除核苷酸，比如Bal31，用Bal31作用于DNA分子的时间越长，所制得的DNA片断就越短。相反，大肠杆菌外切酶III只能够切开DNA双链中的某一条链。（Exonuclease III具有从双链DNA的3'-OH末端降解生成5'-单核苷酸的3'→5'外切酶活性。本酶对双链DNA具有高度特异性，能降解平滑末端、3'凹陷末端及有切口的DNA，但是不能降解3'-突出末端。通过部分降解双链DNA片段，产生一部分单链DNA片段，作DNA聚合酶的底物。）

6. 5'P OH3' 3'HO P5' 核酸酶Bal31的活性

8. OH3' OH3' 5'P 5'P 3'HO P5' P5' 3'HO 5'P OH3' 5'P OH3' P5' 3'HO 3'HO P5' 3'HO P5' 3'HO 5'P 3'HO OH3' P5' P5' RNaseH P5' 3'HO P5' 3'HO ExoIII的外切酶和RNaseH的作用

9. 同样的规则也适用于内切核酸酶，S1内切核酸酶只切断单链，然而从牛胰腺中制得的脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）既能够切断单链也能够切断双链。DNaseI是一种非特异的内切酶，能够打断DNA内部的任意磷酸二酯键，另一方面，称作限制性内切酶的一组特殊的酶能够在特定的位点切开双链DNA分子。同样的规则也适用于内切核酸酶，S1内切核酸酶只切断单链，然而从牛胰腺中制得的脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）既能够切断单链也能够切断双链。DNaseI是一种非特异的内切酶，能够打断DNA内部的任意磷酸二酯键，另一方面，称作限制性内切酶的一组特殊的酶能够在特定的位点切开双链DNA分子。

10. 5' ExoIII 5' S1 S1 S1 Poly(A) 5' S1 Poly(A) 5' S1 5' 5' S1 核酸酶S1活性

11. DNaseI 作用特点 Mn++存在时 Mg++存在时 DNaseI HO P DNaseI与 Pol I 的 切口移位 5’ 3’ Pol I 5’ 3’ 5’ 3’

12. 4.1.2 连接酶 细胞中连接酶作用是修复单链上的切口（断裂），这些断裂是在DNA分子复制的过程中形成的。

13. 4.1.3 聚合酶 DNA聚合酶能够合成一条与已知模板DNA或RNA互补的DNA链，通常只有当模板上具有引物时，聚合酶才能发挥作用。 基因工程中通常用到4种DNA聚合酶。第一种是DNA聚合酶I，它是从大肠杆菌中制得的。当双链DNA分子中存在一个短的单链区时，DNA聚合酶I会以单链区为模板，合成互补链填补缺口。DNA聚合酶 I具有多种酶活性它除具备5’至3’的合成酶活性，还具备5’至3’DNA水解酶活性。

14. DNA聚合酶I的聚合酶活性和水解酶活性受到酶分子上不同部位的控制。其中，水解酶活性包含在多肽链前223个氨基酸中，因此切掉此部分后所得到的经过修饰的酶仍保留DNA聚合酶的活性，但已经不能再水解DNA了。这种修饰后的酶称作Klenow片段。DNA聚合酶I的聚合酶活性和水解酶活性受到酶分子上不同部位的控制。其中，水解酶活性包含在多肽链前223个氨基酸中，因此切掉此部分后所得到的经过修饰的酶仍保留DNA聚合酶的活性，但已经不能再水解DNA了。这种修饰后的酶称作Klenow片段。

16. 在PCR中使用的Taq DNA聚合酶是细菌Thermus aquaticus中的DNA聚合酶 I。这种细菌生活在温度很高的温泉中，因此它的许多酶都是热稳定性的，包括Taq聚合酶。这就意味着它们能够在热处理的条件下保证不会发生变性。正是这一特殊性质使得Taq聚合酶适用于PCR反应。如果它不具有热稳定性，当温度升到94 C使DNA变性时，聚合酶也会因变性而失活。 基因工程中最后一种DNA聚合酶是逆转录酶。这是一种参与一些病毒基因组复制的酶。这种酶以RNA为膜板合成一条互补的DNA（cDNA）。

17. 4.1.4 DNA修饰酶 通过添加或删除化学基团来修饰DNA分子的酶，统称为DNA修饰酶。下面将对其中一些最重要的酶加以介绍： （1）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）（从大肠杆菌、牛肠组织、北极虾中提取），去除DNA分子的5’磷酸基团。 （2）多核苷酸激酶(polynucleotide kinase)（从T4噬菌体侵染的大肠杆菌细胞中提取），和碱性磷酸酶的活性相反，在DNA分子5’游离末端添加磷酸基团。

18. （3）末端转移酶（terminal transferase）（从小牛胸腺组织中提取），在DNA分子的3’末端添加一个或多个脱氧核苷酸。一种不需要模板而催化脱氧核糖核苷酸加到DNA链的3’－羟基端。 4.1.5 拓扑异构酶 最后一类DNA操作酶是拓扑异构酶，它能够通过引入或去除超螺旋来改变共价闭合环状DNA的构象。尽管它的重要性主要体现在DNA复制的研究中，但是在基因工程中也占有一席之地。

19. 4.2 限制性内切酶 在进行重组DNA分子的构建时，每一个载体必须在一个单一位点被切断，以打开环状DNA分子使新的DNA片断能够插入到载体中。同时也要对要克隆的DNA进行切割。

20. 有两点原因：首先，如果以克隆单个基因为目的，该单个基因可能仅仅包含2或3 KbDNA，则这个基因不得不从大的DNA分子中切割下来；其次，大的DNA分子不得不被切割成小的能够被载体携带的片断，绝大多数载体所能够承载的DNA片断处于特定的大小范围内，比如，以M13噬菌体为基础构件的载体所能携带的DNA片断一般不能超过3 Kb。 纯化后的限制性内切酶使生物学家能够以一种可重复的方式切割DNA。限制性内切酶的发现是基因工程发展过程中的一项突破性进展。

21. 4.2.1 限制性内切酶的发现及其功能 在20世纪50年代初，人们观察到有一些细菌对噬菌体的侵染有免疫力，这种现象被称为宿主调控性限制，它的最终导致了限制性内切酶的发现。 限制性机制其实并不复杂，尽管全面了解它花费了20多年的时间。限制的发生是因为细菌产生了一种降解噬菌体DNA的酶，这种酶能够在噬菌体DNA进行复制以前将其降解掉。细菌本身的DNA却不受这种攻击，因为其携带的甲基基团阻断了酶的活动。

22. 这种酶被称作限制性内切酶，能够为很多细菌所合成。现如今已经有超过1 200种不同的限制性内切酶被发现。

23. 4.2.2 限制性内切酶II在特定的核苷酸序列处切割DNA 限制性内切酶II（以后简称限制性内切酶）都有一段特定的识别序列，在这段序列上它们才能切割DNA分子。特定的酶在特定的识别序列上切割DNA而不会在其他地方切割。如，PvuI只在CGATCG这6核苷酸处切割DNA。相对应地，从同一细菌中分离出的另一种酶，称作PvuII，在CAGCTG处切割DNA。

24. 很多限制性内切酶6核苷酸序列，而另一些则识别4、5、甚至8核苷酸序列。Sau3A能够识别GATC，而AluI在AGCT位点进行切割。HinfI能够识别GANTC，即能够在GAATC，GATTC，GAGTC和GACTC位点进行切割。很多限制性内切酶6核苷酸序列，而另一些则识别4、5、甚至8核苷酸序列。Sau3A能够识别GATC，而AluI在AGCT位点进行切割。HinfI能够识别GANTC，即能够在GAATC，GATTC，GAGTC和GACTC位点进行切割。 几乎所有的识别序列都是回文结构。

25. Here's an example: There is an enzyme called BamHI that searches for the sequence GGATCC in double-stranded DNA (by which I mean that the bottom strand is also present): When the sequence is located, the enzyme BamHI digests the phosphodiester backbone in two specific places - between the pair of G nucleotides on each strand. That leaves us with a four nucleotide single stranded 5' end on each side after separation. 5'-GGATCC-3' 5'-G -3' 5'- GATCC-3' 3'-CCTAGG-5' 3'-CCTAG -5' 3'- G-5'

26. In reality there are more than six nucleotides on each strand, of course. The Bam HI just looks for the specific sequence it's interested in, and will accept no substitutes:

27. SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCC-OH 3’-GGG- p + p -GGG-3’ OH-CCC-5’ 4.2.3 平末端和黏末段 当限制性内切酶去切割双链DNA分子上的靶序列时，如果它在两条链的对应位置上切断磷酸二酯键，则会产生平末端（blunt end）。

28. 然而，还有还有大量的限制性内切酶以一种稍微不同的方式切割DNA。在这些酶的作用下，DNA的两条链在不同的位置被切开，形成一种交错切口，两条链上的切口通常会相隔2或4个核苷酸，这样所得的DNA片段会具有短的5’或3’单链突出，突出的单链末端称为黏性末端(cohesive ends)。

31. 3’ protruding ends 5’ protruding ends 黏性末端（ Cohesive/sticky ends)

32. In biology, sticky end (cohesive end) and blunt end are the two possible configurations resulting from the breaking of double-stranded DNA. If two complementary strands of DNA are of equal length, then they will terminate in a blunt end, as in the following example: 5'-CTGATCTGACTGATGCGTATGCTAGT-3' 3'-GACTAGACTGACTACGCATACGATCA-5‘ However, if one strand extends beyond the complementary region, then the DNA is said to possess an overhang: 5'-ATCTGACT-3' 3'-TAGACTGACTACG-5'

33. If another DNA fragment exists with a complementary overhang, then these two overhangs will tend to associate with each other and each strand is said to possess a sticky end: 5'-ATCTGACT + GATGCGTATGCT-3' 3'-TAGACTGACTACG CATACGA-5' which can form complementary base-pairs: GATGCGTATGCT-3' 5'-ATCTGACT CATACGA-5' 3'-TAGACTGACTACG

34. 黏末端之间的碱基配对能够将DNA分子重新连接起来。不同的限制性内切酶可以产生出相同的粘性末端。Bam I（识别序列是GGATTC）和Bgl II （识别序列AGATCT）都能够产生GATC黏末端。相同的黏末端还能够被Sau3A产生出来，而它识别的序列是GATC，经这些酶切割的DNA片断，都能够通过互补的黏末端连接在一起。

35. Factors that influence restriction efficiency • Buffer composition: • Different restriction enzymes have differing preferences • for ionic strength (salt concentration) • and major cation (sodium or potassium). Battery of 4 commercial buffers overlaps whole spectrum but some enzymes are more fussy 2. Temperature conditions best at 37C, but there are many exceptions. -- Enzymes from termofilic organisms cut best at 50-65 C -- Some enzymes are unstable, so better use them at 25 C

36. Factors that influence restriction efficiency 3. Methylation a number of restriction endonucleases will not cleave methylated DNA !!! Most E.coli strains contain Dam methylase (GmATC) and Dcm methylase CmC(A/T)GG if DNA unexpectedly does not cut or cuts only partially, check that the enzyme in question is not methylation-sensitive. arbl.cvmbs.colostate.edu

37. Factors that influence restriction efficiency 4. Star activity In the non-standard conditions: -- High pH (>8.0) or low ionic strength (e.g. if you forget to add the buffer) -- Glycerol concentrations > 5% (you took too much enzyme from 50% gly stock) -- Presence of organic solvents in the reaction (e.g. ethanol, DMSO) Cleavage can occur within a number of sequences that differ from the canonical GAATTC by a single base substitutions

38. Sticky ends and blunt ends 5’ overhangs 3’ overhangs blunt ends arbl.cvmbs.colostate.edu

39. 4.2.4 DNA分子中识别序列出现的频率 对特定的限制性内切酶来说，在已知长度的DNA分子中识别序列的数量能够通过数学方法计算出来。一个4核苷酸序列（比如GATC）每44=256个核苷酸出现一次。这一算法假定以一种随机的方式排列而4个不同的核苷酸以相同的频率出现。实际上，这种假设不可能完全有效。比如说，λDNA分子，49 Kb，对一个6核苷酸识别序列的限制性内切酶来说，本应该有12个酶切位点，而实际上，这些识别位点出现的频率要小一些，比如说，对BglII有6个,BamHI有5个，对SalI只有两个。

40. 4.2.4在实验室条件下进行限制性酶切 我们以Bgl II为例考虑限制性酶对λDNA样品的消化。 首先，将所需要用量的DNA转移到离心管中。要进行限制酶切的DNA用量取决于实验本身的要求：在这里将消化包含在16 μl样品中2 μg λDNA。反应中另外一种主要成分是限制性内切酶，它是从供应商那里获得的纯的酶夜。但是在加入酶之前，必须对包含DNA的溶液进行调整，为内切酶发挥最大活性提供最合适的条件。

41. 绝大多数限制性内切酶的最适pH在7.4左右，但是不同的酶对离子强度（通常由氯化钠提供）和镁离子浓度的要求不尽相同。绝大多数限制性内切酶的最适pH在7.4左右，但是不同的酶对离子强度（通常由氯化钠提供）和镁离子浓度的要求不尽相同。 加入一种还原剂也是一种很好的做法，比如二硫苏糖醇（DTT），它能够使内切酶稳定并防止其失活。为内切酶提供合适的环境非常重要——不当的氯化钠和镁离子浓度不但会降低限制性内切酶的活性，还会导致酶的专一性的改变，使其切割非标准的识别序列。

42. 假设反应混合液的最终体积是20 μl，我们加入2μl 的10×BglII缓冲液到16μl DNA溶液中。 现在可以加入限制性内切酶了，根据惯例，1个酶单位被定义为在1 h内切割1μg DNA所需的酶量，因此我们需要2个单位的BglII来切割2μg 的λDNA。BglII通常为4单位/μl，因此0.5μl就足够切割DNA 了。所以反应混合液中最终加入0.5μl 的酶和1.5μl 的水，这样就构成了20μL的最终体积。

43. 最后一个要考虑的因素是反应温度。绝大多数限制性内切酶，包括BglII，在37℃时活性达到最大，但是还要注意还有一小部分酶需要不同的工作温度。比如Taq I是从中提取的限制性内切酶，像Taq DNA聚合酶那样具有很高的最适工作温度。使用TaqI进行消化要在65 ℃下进行，此时酶的活性最高。

44. What does a restriction enzyme need in order to do its duty?1. A double-stranded DNA sequence containing the recognition sequence.2. Suitable conditions for digestion.For example, BamHI has the recognition sequence: GGATCC and requires conditions similar to this: 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)5 mM Magnesium chloride100 mM NaCl1 mM 2-mercaptoethanolReaction conditions: 37 C

45. 限制性酶切经过1 h的反应就该结束了。如果酶切下来的DNA片断要用于克隆实验，则需要消除反应液中的酶活性，以保证它不会以外消化掉那些将在以后步骤中加入的其他DNA分子。

46. 在很多情况下，在70 ℃保存很短一段时间就足够使限制性内切酶失活。而对于其他无法通过提高温度灭活的酶，需要使用苯酚抽提或者加入乙二胺四乙酸盐（EDTA），它能够螯合酶离子以阻止限制酶的作用。

47. 4.2.6 对酶切结果进行分析 通过限制性酶切可以得到一定数量的DNA片断，酶切片断的大小取决于初始DNA分子中内切酶识别序列的确切位置。 DNA带负电荷，因此，当DNA分子被置于电场中时它们就会向阳极迁移。这样就可以通过凝胶电泳（gel electrophoresis）对不同大小的DNA片段进行分离。

50. 凝胶通常是由琼脂糖、聚丙烯烯胺制成的，含有复杂的孔道网络，DNA必须通过这些孔道才能到达阳极。小的DNA分子，在凝胶中迁移得更快。因此，利用凝胶电泳可以把不同大小的DNA分子分开。凝胶通常是由琼脂糖、聚丙烯烯胺制成的，含有复杂的孔道网络，DNA必须通过这些孔道才能到达阳极。小的DNA分子，在凝胶中迁移得更快。因此，利用凝胶电泳可以把不同大小的DNA分子分开。