D é tection optique de biomol é cules uniques

1. Détection optique de biomolécules uniques Maxime Dahan Laboratoire Kastler Brossel Département de physique Ecole normale supérieure

2. Présentation générale • Microscopie de fluorescence • description simple d’un système fluorescent • sondes fluorescentes : colorants, GFP, nanocristaux • Détecter une molécule unique • Rapport signal sur bruit, bruit de photon,… • Approches expérimentales • Applications en biophysique • Résolution vs localisation : mouvement de la myosin V, microscopie ultrarésolution • « Motility assays »: myosine/actine, kinesine/microtubule, protéine/ADN • Mesure en polarisation: dynamique rotationelle de F1-ATPase • Relation Conformation/Dynamique : approche par transfert d’énergie de Forster et par transfert électronique – étude du répliement des protéines • Suivi de molécules uniques en cellules vivantes : diffusion membranaire, expression genique

3. Motivations :« aller au-delà des valeurs moyennes » • fluctuations statistiques : En analysant molécule par molécule, on peut identifier et analyser les inhomogénéités dans l’échantillon

4. Motivations (2) :pour analyser des processus stochastiques • fluctuations dynamiques : En mesurant l’état d’une molécule au cours du temps, on peut déterminer les constantes cinétiques qui gouvernent son évolution, même si on est à l’équilibre

5. Mesure d’ensemble :

6. (cf. JFA – cours n°2)

7. Historique

8. Canaux ioniques Neher et Sackmann (1976) [Prix Nobel 1991]

9. Mesures optiques • détection optique d’une molécule unique • mesure à basse température (1989) • mesure à température ambiante (1992-1994) • premières expériences sur des biomolécules in vitro : • activité enzymatique d’une cholestérol oxydase (1998) • conformation de petites molécules d’ADN et ARN (1999) • activité d’une exonucléase (1999) • premières expériences in vivo: • suivi de l’entrée d’un adéno-virus (2001) • diffusion latérale de canaux calciques (2001) • organisation membranaire de récepteurs dans des amibes Dictyostelium discoideum (2001)

10. Microscopie de fluorescence

11. Fluorescence Lorsqu’ils sont dans un niveau excité, certains systèmes (atomes, molécules, cristaux,…) peuvent se désexciter en émettant des photons. excitation La longueur d’onde d’émission est (souvent) plus grande que plus celle d’absorption et il est possible de sélectionner spectralement la lumière émise → microscopie de fluorescence

12. Microscopie de fluorescence Il s’agit donc d’une détection sur fond noir

13. Voir des biomolécules en fluorescence • En général, les molécules biologiques (protéines, acides nucléiques,…) ne sont pas fluorescentes dans le visible (quelques exceptions: flavines, NADH, GFP,…). Certains acides aminés ont néanmoins des propriétés de fluorescence dans l’UV (tryptophane). • On attache spécifiquement des marqueurs fluorescents : • couplage covalent (liaison chimique) • marquage d’affinité: on utilise une molécule fluorescente qui vient s’attacher spécifiquement (anticorps, toxines,…) • clonage d’une protéine fluorescente

15. Modèle d’un système fluorescent à deux niveaux

16. |e> |g> Description d’un système fluorescent à 2 niveaux La molécule peut se désexciter de deux manières différentes : en émettant un photon ou non radiativement. Tfluo est la durée de vie radiative s est la section efficace d’absorption e est le coefficient d’extinction

17. Taux de fluorescence G Solution à l’état stationnaire:

18. Cas limites A faible intensité, régime linéaire : Efficacité quantique radiative probabilité qu’un photon absorbé soit réémis A forte intensité, régime saturée : Pour gagner en signal sur bruit, on essaie toujours d’avoir I << Is

20. Etude résolue en temps Si on excite avec un laser pulsé (à la fréquence 1/Trep): Si on connaît : On peut déterminer kr et knr

21. Marqueurs fluorescents: molécules, protéines, nanocristaux

22. Fluorophores organiques

23. Diagramme de Jablonski

24. système à trois niveaux On prend en compte l’état triplet

25. Green fluorescent protein Découverte en 1961 dans la méduse Aequorea Victoria, clonée en 1992

27. Absorption Fluorescence

28. Autres mutants/ Autres couleurs : R. Tsien, FEBS Lett. 2005 • Aussi, des mutants: • photoactivables, • dont l’émission change dans le temps • sensibles au calcium • indicateurs de la phosphorylation • …

29. ZnS CdSe Nanocristaux semiconducteurs Nanoparticules composées de 100 à 100000 atomes of CdSe recouverts par une coquille de ZnS 2-5 nm

30. V(x) 0 L Des boites quantiques de quelques nanomètres Quels sont les niveaux d’énergie des électrons ? Une particule dans une boite à 1 D : Fonctions propres: Energies propres: (en fait la boite est tridimensionnelle…)

31. absorption 5.0 nm CdSe 2.2 nm CdSe Emission et absorption ajustable avec la taille des nanoparticules L L Plus les particules sont petites, plus l’emission est décalée vers les courtes longueurs d’onde (grandes énergies)

32. Semiconductor Quantum Dots

33. Spécificités spectrales et photophysique des nanocristaux par rapport à des émetteurs organiques Nanocristal Colorant taille • emission etroite (quasi-atomique) • absorption large (solide) • photostabilité Longueur d’onde Excitation

34. Détection de molécules fluorescentes uniques

35. Problème de détection: quel est le rapport signal sur bruit ? • Signal S de fluorescence (d’une seule molécule) • Bruit B de variance de moyenne mB et de variancesB:

36. Sources de bruit • Fluctuations intrinsèques (bruit de photon / shot noise) • Signal optique parasite (autofluorescence, lumière diffusée,…) • proportionnel à l’intensité lumineuse I • Bruit électronique (courant d’obscurité, bruit de lecture,…) • indépendant de l’intensité lumineuse

37. Bruit de Photon et Processus de Poisson On considère un flux où des particules (des photons) arrivent avec un taux k sur un détecteur (une photodiode). On fait l’hypothèse que ce qui se passe entre t et (t+dt) est indépendant de ce qui se passe entre 0 et t (processus de Markov).

38. Quel est la distribution du temps d’attente du premier evènement ? Quelle est la probabilité P qu’on ne détecte rien entre 0 et t ? Quelle est la probabilité de détecter n photons durant le temps t ? (distribution de Poisson)

39. Distribution de Poisson Valeur moyenne : Variance :

40. Bruit d’origine lumineuse • Bruit de photons des molécules (non saturées): • Bruit dû à la lumière parasite :

41. Sources de bruit électronique lecture Nombre de coups Lumière incidente Crée des photolélectrons • Courant d’obscurité : du à l’apparition de Nobsphotoélectrons à cause du bruit thermique (proportionnel au temps) • Bruit noir de lecture : dû au convertisseur analogue-digital

42. Rapport signal sur bruit Cas limite du « shot noise »:

43. (molécule de Cy3) Identifier un fluorophore unique Pour un fluorophore : photodestruction instantanée Possibilité de réduire le photobleaching avec des « oxygen scavengers »

44. Scintillement d’un nanocristal unique

45. Tableau comparatif

46. Approches expérimentales

47. Champ proche Betzig (1992,1994)

48. Microscopie de champ lointain : microscopie confocale

49. Veff = 1x1x1 µm3 = 1 fl C < 1 nM t ~ L²/4D ~ 0.1-1 ms Mesure en diffusion Chaque molécule qui traverse par diffusion le volume de focalisation émet des photons Détection de molécules uniques si : (FCS: C = 5-10 nM) Temps de diffusion: Analyse des corrélations temporelles: FCS Nie and Zare, Science (1994)

50. Laser Microscopie en balayage On déplace le point de focalisation sur l’échantillon. Objectif Trou de filtrage Photodiode, PM