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E N D
1. Genética molecular dos sistemas eritrocitários: importância na prática clínica
2. Os sistemas eritrocitários são constituídos por antigenos de grupos sanguíneos definidos por aloanticorpos. Apresentam ampla diversidade incluindo atualmente 29 sistemas, 34 locus, 239 antígenos e > 620 alelos. O maior sistema eritrocitário é o sistema Rh, seguido pelo MNS, Kell e Diego.Os sistemas eritrocitários são constituídos por antigenos de grupos sanguíneos definidos por aloanticorpos. Apresentam ampla diversidade incluindo atualmente 29 sistemas, 34 locus, 239 antígenos e > 620 alelos. O maior sistema eritrocitário é o sistema Rh, seguido pelo MNS, Kell e Diego.
3. Modelo de membrana: inserção dos antígenos de grupos sanguíneos Os antígenos eritrocitários são carbohidratos ou proteínas localizados em glicolípides ou proteínas da superfície da membrana eritrocitária ou proteínas ligadas a glicosilfosfatidilinositol. Atravessam uma única vez (tipos 1 e 2) a membrana ou apresentam múltiplas passagens. Os antígenos eritrocitários são carbohidratos ou proteínas localizados em glicolípides ou proteínas da superfície da membrana eritrocitária ou proteínas ligadas a glicosilfosfatidilinositol. Atravessam uma única vez (tipos 1 e 2) a membrana ou apresentam múltiplas passagens.
4. Os genes de 28 dos 29 sistemas já foram clonados e sequenciados, apenas o gene que codifica os antígenos dos sistema P não foi ainda sequenciado. Assim, os polimorfismos de GS podem ser definidos ao nível genético e análise molecular destes genes pode ser útil na clínica. Além disto, o entendimento das bases moleculares de GS permitem explorar as funções das proteínas que os carreiam.Os genes de 28 dos 29 sistemas já foram clonados e sequenciados, apenas o gene que codifica os antígenos dos sistema P não foi ainda sequenciado. Assim, os polimorfismos de GS podem ser definidos ao nível genético e análise molecular destes genes pode ser útil na clínica. Além disto, o entendimento das bases moleculares de GS permitem explorar as funções das proteínas que os carreiam.
5. Antígenos de grupos sanguineos estão localizados em moléculas funcionais Este conhecimento permitiu demonstrar que os antígenos de GS estão localizados em moléculas funcionais na membrana eritrocitária e assim foram classificados em 6 grupos de acordo com as funções de cada molécula. Este conhecimento permitiu demonstrar que os antígenos de GS estão localizados em moléculas funcionais na membrana eritrocitária e assim foram classificados em 6 grupos de acordo com as funções de cada molécula.
6. Mecanismos moleculares que levam à diversidade dos antígenos de grupos sanguíneos Os mecanismos moleculares que levam a diversidade dos antigenos de GS incluem: SNPs, inserções, deleçoes, rearranjos gênicos. Sem dúvida o SNP( troca de 1 nucleotídeo com substituição de 1 aminoácido) é o mais comum. A partir do momento que se conhece as bases moleculares é possível identificar o polimorfismo de GS através da análise de DNA.Os mecanismos moleculares que levam a diversidade dos antigenos de GS incluem: SNPs, inserções, deleçoes, rearranjos gênicos. Sem dúvida o SNP( troca de 1 nucleotídeo com substituição de 1 aminoácido) é o mais comum. A partir do momento que se conhece as bases moleculares é possível identificar o polimorfismo de GS através da análise de DNA.
7. SNPs (mutações de ponto missenses) Os mecanismos moleculares que levam a diversidade dos antigenos de GS incluem: SNPs, inserções, deleçoes, rearranjos gênicos. Sem dúvida o SNP( troca de 1 nucleotídeo com substituição de 1 aminoácido) é o mais comum. A partir do momento que se conhece as bases moleculares é possível identificar o polimorfismo de GS através da análise de DNA.Os mecanismos moleculares que levam a diversidade dos antigenos de GS incluem: SNPs, inserções, deleçoes, rearranjos gênicos. Sem dúvida o SNP( troca de 1 nucleotídeo com substituição de 1 aminoácido) é o mais comum. A partir do momento que se conhece as bases moleculares é possível identificar o polimorfismo de GS através da análise de DNA.
8. Transcrição
9. Rearranjos gênicos
10. Métodos de análise de DNA Amplificação do DNA por PCR
PCR-RFLP
PCR-alelo-especifico
PCR-multiplex
Amplificação (PCR) + sonda-especifica (probe)-Real time PCR
TaqMan
Molecular beacons
Microarray – chips Os métodos de análise de DNA incluem> PCR-RFLP (PCR + enzima de digestão), AS-PCR, PCR multiplex. Estes métodos tem sido os mais frequentemente utilizados e necessitam de análise por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida
Real time PCR (amplificação + sonda específica marcada com fluoresceína (taqman) ou sinais moleculares são utilizados para realização de PCR quantitativos ou detecção de baixas concentrações de DNA. Não utiliza eletroforese em gel.
Microarrays tecnologia chip: método que está ganhando um grande espaço para genotipagem de GS em larga escala (screening de doadores) pois permite automação e identificação de vários alelos de uma única vez. Os métodos de análise de DNA incluem> PCR-RFLP (PCR + enzima de digestão), AS-PCR, PCR multiplex. Estes métodos tem sido os mais frequentemente utilizados e necessitam de análise por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida
Real time PCR (amplificação + sonda específica marcada com fluoresceína (taqman) ou sinais moleculares são utilizados para realização de PCR quantitativos ou detecção de baixas concentrações de DNA. Não utiliza eletroforese em gel.
Microarrays tecnologia chip: método que está ganhando um grande espaço para genotipagem de GS em larga escala (screening de doadores) pois permite automação e identificação de vários alelos de uma única vez.
11. PCR-RFLP (Polimorfismo Duffy) Ex PCR-RFLPEx PCR-RFLP
12. RFLP para genotipagem Duffy RFLP para genotipagem FY. Aqui temos um fragmento de 392 pb que é o produto de PCR amplificado, onde se observa um sítio de restrição comum para Ban I que o corta em 2 fragmentos. No entanto, a mutação FYA gera um sítio adicional cortando o fragmento maior de 306 pb em 2. Assim nesta figura podemos ver um RFLP para FY após eletroforese em gel de poliacrilamida RFLP para genotipagem FY. Aqui temos um fragmento de 392 pb que é o produto de PCR amplificado, onde se observa um sítio de restrição comum para Ban I que o corta em 2 fragmentos. No entanto, a mutação FYA gera um sítio adicional cortando o fragmento maior de 306 pb em 2. Assim nesta figura podemos ver um RFLP para FY após eletroforese em gel de poliacrilamida
13. PCR Alelo-Especifico (AS-PCR): Ss AS-PCR paa genotipagem Ss. Amplificação de cada alelo é separada utilzando-se primers específicos para a mutação polimórfica. Utiliza-se sempre um controle interno da reação.AS-PCR paa genotipagem Ss. Amplificação de cada alelo é separada utilzando-se primers específicos para a mutação polimórfica. Utiliza-se sempre um controle interno da reação.
14. PCR Multiplex: RHCE Cc e RHDy PCR multiplex. Ex: genotipagem RHD. Cc utilzando em uma mesma reação vários pares de primers que reconhecem as diferentes mutações polimórficas. PCR multiplex. Ex: genotipagem RHD. Cc utilzando em uma mesma reação vários pares de primers que reconhecem as diferentes mutações polimórficas.
15. Real Time PCR Real time PCR. Não utiliza gel e possibilita quantificação do DNA presente. Método mais sensível e tem sido utilizado na genotipagem fetal em plasma materno.Real time PCR. Não utiliza gel e possibilita quantificação do DNA presente. Método mais sensível e tem sido utilizado na genotipagem fetal em plasma materno.
16. Microarray. Técnica que está sendo padronizada para determinaçaõ de vários polimorfismos. Até 100 alelos em uma única reação. Alternativa para genotipagem em larga escala. Em uma lâmina é colocado um chip contendo micropartículas coloridas que se tornam funcionais com a ligação de uma sonda de oligonucleotídeos marcada com flouresceína contendo uma sequencia complementar específica para um determinado alelo. Assim para cada alelo existe uma cor específica. Quando esta sonda se hibridiza com o alelo presente na amostra de DNA há emissão de fluorescênciaMicroarray. Técnica que está sendo padronizada para determinaçaõ de vários polimorfismos. Até 100 alelos em uma única reação. Alternativa para genotipagem em larga escala. Em uma lâmina é colocado um chip contendo micropartículas coloridas que se tornam funcionais com a ligação de uma sonda de oligonucleotídeos marcada com flouresceína contendo uma sequencia complementar específica para um determinado alelo. Assim para cada alelo existe uma cor específica. Quando esta sonda se hibridiza com o alelo presente na amostra de DNA há emissão de fluorescência
17. Microarray – Tecnologia Chip Esta técnica não elimina a realização do PCR. Assim, um PCR multiplex é realziado com um conjunto de primers específicos para vários polimorfismos. Estes primers são fosforilados. Após limpeza do PCR para retirada de primers e dntp e separação das fitas, é realizada uma reação enzimática para hibridização das fitas com as sequencias complementares presentes nas sondas de cada microparícula do chip. Assim quando ocorre a hibridização há emissão de luorescência que é capturada por um sistema de imagem a automático. Esta técnica não elimina a realização do PCR. Assim, um PCR multiplex é realziado com um conjunto de primers específicos para vários polimorfismos. Estes primers são fosforilados. Após limpeza do PCR para retirada de primers e dntp e separação das fitas, é realizada uma reação enzimática para hibridização das fitas com as sequencias complementares presentes nas sondas de cada microparícula do chip. Assim quando ocorre a hibridização há emissão de luorescência que é capturada por um sistema de imagem a automático.
20. Fontes de DNA que podem ser utilizadas para genotipagem Sangue (Leucócitos)
Células do epitélio bucal
Urina (células no sedimento urinário)
Líquido amniótico (amniócitos)
DNA fetal em plasma materno
21. Genotipagem em larga escala para identificação de antígenos comuns e raros (Programa de hemácias fenotipadas)
Produção de painéis complementares
Zigozidade D, Fya, Fyb : controle de qualidade de reagentes
Determinação dos tipos de D fraco e D parcial
Identificação de novos alelos Genética molecular dos sistemas eritrocitários: aplicações
22. Genética molecular dos sistemas eritrocitários: aplicações Resolução de casos clínicos em situações que os testes de hemaglutinação não fornecem resultados seguros (pacientes recém-transfundidos, pacientes portadores de AHAI aloimunizados)
Resolução de discrepâncias ABO e Rh
Determinação de microquimerismo após transplante de stem cell alogênico
Identificação de fenótipos fracos e deprimidos (D fraco, e fraco)
Investigação e confirmação de fenótipos raros (DI, DO, SC, CO)
Identificação de variantes raras (D parcial + e parcial)
Identificação de novos alelos
Outras importantes aplicações da genotipagem de grupos sanguíneos incluem: a confirmação de discrepancias ABO/Rh, a determinação da zigosidade do antígeno RhD, principalmente em pais de fetos de mães RhD negativo sensibilizadas, na determinação de antígenos fracos ou deprimidos muitas vezes difíceis de serem detectados por hemaglutinação; na caracterização de antígenos RhD parciais, especialmente a categoria DIIIa; na identificação de pacientes Fy(b-) que podem ser seguramente transfundidos com hemácias Fy(b+) ou seja, aqueles pacientes que possuem o gen FYB silencioso nas hemácias devido a uma mutação no gen promotor. Outras importantes aplicações da genotipagem de grupos sanguíneos incluem: a confirmação de discrepancias ABO/Rh, a determinação da zigosidade do antígeno RhD, principalmente em pais de fetos de mães RhD negativo sensibilizadas, na determinação de antígenos fracos ou deprimidos muitas vezes difíceis de serem detectados por hemaglutinação; na caracterização de antígenos RhD parciais, especialmente a categoria DIIIa; na identificação de pacientes Fy(b-) que podem ser seguramente transfundidos com hemácias Fy(b+) ou seja, aqueles pacientes que possuem o gen FYB silencioso nas hemácias devido a uma mutação no gen promotor.
23. Zigozidade do gene RHD paterno
Genotipagem RHD fetal
DNA de amniócitos
DNA de origem fetal na circulação materna (usar DNA de plasma materno) Genética molecular dos sistemas eritrocitários: aplicações Algumas das aplicações da biologia molecular no sistema Rh e que vem complementar a sorologia são:Algumas das aplicações da biologia molecular no sistema Rh e que vem complementar a sorologia são:
24. Genotipagem eritrocitária na prática clínica Caso clínico 1:
Paciente politransfundido aloimunizado com anti-E e provável anti-Jkb e história de transfusão recente
Fenotipagem: R2r, K-k+, Fy(a+b-), Jk(a-b+)
25. Caso clínico 1:
Genotipagem:RHD+ RHCE cc ee, K2K2, FY A/FY A, JK A/JK A Genotipagem eritrocitária na prática clínica
26. Caso clínico 2:
Paciente politransfundido com TDA positivo (4+) eluato e soro positivos 4+ com todas as células, história de transfusão recente e evidência clínica de diminuição da sobrevida de hemácias transfundidas
Fenotipagem do paciente: ?
Genotipagem do paciente:
RHD-, RHCE cc ee, K2K2, FY A/FY B, JK A/JK B, Ms/Ns
Análise sorológica complementar
adsorções alogênicas com hemácias rr, K-, S- para retirada do autoac
Conclusão: Aloanticorpos detectados:anti-E, -K Genotipagem eritrocitária na prática clínica
27. Caso clínico 3:
Paciente falciforme aloimunizado com anti-E, anti-K e anti-Jka recebendo sangue fenótipo compatível
Fenotipagem do paciente: R0r, K-k+, Fy(a-b-), Jk(a-b+)
Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc ee , K2K2, FY B/FY B (Gata mutado), JK B/JK B
Conclusão: Paciente pode receber sangue Fy(b+) Genotipagem eritrocitária na prática clínica
28. Caso clínico 4:
Paciente sexo feminino, 27 anos, história de 1 transfusão anterior, nenhuma gestação ou aborto
Aloimunizada com anti-D
Fenotipagem da paciente: D-
Fenotipagem do doador da hemácia transfundida: D-
30. Caso clínico 5:
Paciente falciforme aloimunizado com anti-D e anti-K
Fenotipagem do paciente: R0r (D fraco), K-k+
Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc ee , K2K2
31. Genotipagem complementar: D parcial DAR
32.
D fracos tipos 1> 4> 3> 2 mais frequentes
Anti-D IgM: pacientes; anti-D IgG:doadores
Reatividades < 1+ com anti-D IgG na AGH podem indicar a presença de DAR, DVI, DHMi
33. Caso clínico 6:
Paciente falciforme aloimunizado com anti-e like, anti-E e provável anti-D
Fenotipagem do paciente: B, D+C+E-c+e+
Sangue selecionado para a transfusão: R2R2 e rr (incompatível)
Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc ee ,
Genotipagem complementar (e-parcial): ces (hrB-)
Genotipagem complementar (D-parcial): DIIIa
35. Quando o paciente fenotipado como RhD-negativo apresentar o pseudogene RHD, deve-se considerar o resultado do fenótipo uma vez que o gene RHD? não é expresso. Estes indivíduos podem desenvolver aloanticorpo anti-D se vierem a ser transfundidos com hemácias RhD-positivo.
Em nosso estudo, 2 (18%) dos 11 pacientes RhD-negativo estudados, fenotipados como D-C(+)c+E-e+VS+, apresentaram o gene híbrido. Estas amostras foram RhD-positivas pela análise do exon 10 mas, D-negativas pela análise do intron 4 e exon 7.
Recomenda-se nestes pacientes, a amplificação do gene RHD em diferentes regiões (intron 4, exon 7 e exon 10 onde RHD e RHCE diferem) e a utilização de uma técnica de PCR multiplex que detecta a presença de RHD-CE-Ds (MAASKANT van WIJK et al, 1998) . Pacientes que apresentam o gene híbrido devem ser considerados RhD-negativo.
Quando o paciente fenotipado como RhD-negativo apresentar o pseudogene RHD, deve-se considerar o resultado do fenótipo uma vez que o gene RHD? não é expresso. Estes indivíduos podem desenvolver aloanticorpo anti-D se vierem a ser transfundidos com hemácias RhD-positivo.
Em nosso estudo, 2 (18%) dos 11 pacientes RhD-negativo estudados, fenotipados como D-C(+)c+E-e+VS+, apresentaram o gene híbrido. Estas amostras foram RhD-positivas pela análise do exon 10 mas, D-negativas pela análise do intron 4 e exon 7.
Recomenda-se nestes pacientes, a amplificação do gene RHD em diferentes regiões (intron 4, exon 7 e exon 10 onde RHD e RHCE diferem) e a utilização de uma técnica de PCR multiplex que detecta a presença de RHD-CE-Ds (MAASKANT van WIJK et al, 1998) . Pacientes que apresentam o gene híbrido devem ser considerados RhD-negativo.
36. Caso clínico 7:
Paciente falciforme aloimunizado com anti-C e anti-K
Fenotipagem do paciente: R2R2, K-k+
Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc Ee , K2K2
Genotipagem complementar: VS+, Cys16
Conclusão: e+f (variante): paciente R2r
37. Considerando a importância do antígeno Rhe na medicina transfusional e a associação destas duas variantes com o alelo RH ce em africanos, estudamos a sua ocorrência em 58 pacientes falciformes que apresentavam o alelo RH ce.
A ocorrência simultânea das mutações 48C (Cys16) e 733G (VS) foi observada em 50 pacientes demonstrando que ambas mutações são freqüentes em descendentes de africanos com o alelo RH ce. Estas mutações foram encontradas em heterozigoze sugerindo que estes pacientes apresentavam a mutação 48C em um alelo e a mutação 733G em outro, o que teoricamente levaria a uma fraca expressão do antígeno Rhe nas hemácias. De fato, quando foi realizada a fenotipagem do antígeno Rhe nas hemácias de 10 destes pacientes, empregando cinco anti-soros monoclonais de procedências diferentes, verificou-se que três dos anti-soros utilizados não as aglutinaram, o que demonstra que a expressão do antígeno Rhe encontrava-se enfraquecida.
Se considerarmos que qualquer um dos 3 anti-soros monoclonais por nós utilizados, não detectaram o antígeno Rhe, podem ser empregados na rotina de fenotipagem, estes pacientes poderiam ter sido classificados erroneamente como Rhe-negativo. Este resultado levaria a uma diminuição considerável na disponibilidade de sangue para estes indivíduos, uma vez que o fenótipo Rhe-negativo ocorre na frequência de 1/50 em nossa população. Até o momento, não foi detectado anticorpo anti-e em pacientes que apresentam estas variantes.
Considerando a importância do antígeno Rhe na medicina transfusional e a associação destas duas variantes com o alelo RH ce em africanos, estudamos a sua ocorrência em 58 pacientes falciformes que apresentavam o alelo RH ce.
A ocorrência simultânea das mutações 48C (Cys16) e 733G (VS) foi observada em 50 pacientes demonstrando que ambas mutações são freqüentes em descendentes de africanos com o alelo RH ce. Estas mutações foram encontradas em heterozigoze sugerindo que estes pacientes apresentavam a mutação 48C em um alelo e a mutação 733G em outro, o que teoricamente levaria a uma fraca expressão do antígeno Rhe nas hemácias. De fato, quando foi realizada a fenotipagem do antígeno Rhe nas hemácias de 10 destes pacientes, empregando cinco anti-soros monoclonais de procedências diferentes, verificou-se que três dos anti-soros utilizados não as aglutinaram, o que demonstra que a expressão do antígeno Rhe encontrava-se enfraquecida.
Se considerarmos que qualquer um dos 3 anti-soros monoclonais por nós utilizados, não detectaram o antígeno Rhe, podem ser empregados na rotina de fenotipagem, estes pacientes poderiam ter sido classificados erroneamente como Rhe-negativo. Este resultado levaria a uma diminuição considerável na disponibilidade de sangue para estes indivíduos, uma vez que o fenótipo Rhe-negativo ocorre na frequência de 1/50 em nossa população. Até o momento, não foi detectado anticorpo anti-e em pacientes que apresentam estas variantes.
38. Caso clínico 8:
Paciente talassêmico aloimunizado com anti-c, anti-K, anti-Jka e outro aloac? Recebendo sangue fenótipo compatível
Fenotipagem do paciente: R0r, K-k+, Fy(a+b-), Jk(a-b+), M+N+S+s+
Genotipagem do paciente:
RHD+ RHCE cc ee, K2K2, FY A/FY A, JK B/JK B, MS/Ns
39. Caso clínico 8:
Análise molecular complementar:
DO A/DO A
Análise sorológica complementar
adsorção com hemácias R0r, K-, Fy(b-), Jk(a-), Do(b+) /eluição): anti-Dob
Conclusão: Paciente portador de anti-c, -K, -Jka, Dob
40. Identificação de anticorpos anti-Do
Possibilidade de genotipar os doadores e selecionar hemácias antígeno-negativas
Maior aproveitamento transfusional
41. Caso clínico 9:
Gestante aloimunizada (200 semana)
Anticorpo identificado: Anti-D (título: 512)
Fenótipo da paciente: rr
42. Zigozidade paterna Genotipagem RHD fetal
43. Caso clínico 10:
Gestante aloimunizada (120 semana)
Anticorpo identificado: Anti-D (título: 512)
Fenótipo da paciente: rr
44. Zigozidade paterna Genotipagem RHD fetal
45. Situações em que genótipo e fenótipo podem não corresponder Transfusões crônicas/maciças
Alteração no gene afetando: transcrição (Fyb-); splicing (S-s-); introdução de stop codon (Fy(a-b-), Rhnull), ou mutação que afeta a estabilidade da proteina na membrana da célula (Fyx)
Crossing overs e outros rearranjos gênicos (RHD/RHCE)
Alteração em outro gene que está associado com a expressão do gene : RHAG ?Rhnull
46. Implementação da genotipagem para uso clínico Amostras de sangue fenotipadas devem ser analisadas por PCR em estudo cego para avaliação do método
O número de amostras usadas na validação de um teste deve incluir o máximo de variantes genéticas presentes na população para a qual o teste vai ser utilizado
População Europeia Vs População Brasileira
Revalidação do teste com novas variantes
Participação em testes de proficiência
47. Genética molecular dos sistemas eritrocitários na população brasileira Melhoria da qualidade e exatidão dos resultados imunohematológicos
Determinação de novas variantes alélicas não descritas em outras populações (DIA/166A, FY145, Rhnull)
Identificação de variantes alélicas de origem Africana (GATA, RHD?, RHD-CE-Ds, VS, DIIIa, DAR)
Elaboração de protocolos de genotipagem eficientes One particular area where molecular genotyping can have value in the clinical setting is to identify a fetus at risk from alloantibodies to blood groups and platelet antigens.
A second area of focus in the clinical laboratory is in the resolution of clinical cases where hemagglutination assays can not provide conclusisve results, for example in multi-transfused patients as an aid in the antibody identification process.
A third area of clinical utility is in typing blood donors with unclear phenotype.One particular area where molecular genotyping can have value in the clinical setting is to identify a fetus at risk from alloantibodies to blood groups and platelet antigens.
A second area of focus in the clinical laboratory is in the resolution of clinical cases where hemagglutination assays can not provide conclusisve results, for example in multi-transfused patients as an aid in the antibody identification process.
A third area of clinical utility is in typing blood donors with unclear phenotype.
48. Genotipagem de grupos sanguíneos na clínica requer:
Conhecimento em grupos sanguíneos
Experiência na interpretação das reações de PCR utilizadas
Obtenção dos achados sorológicos e da história clínica do paciente antes de interpretar os resultados da genotipagem
Conhecimento dos genes que codificam os antígenos de GS e suas formas variantes (fenótipos e genótipos podem não correlacionar) na população estudada
49. A genotipagem de grupos sanguíneos é uma ferramenta útil na medicina transfusional e apresenta gradualmente um número crescente de aplicações. Torna-se poderosa quando associada a hemalutinação
Os métodos moleculares permitem obter um melhor conhecimento da distribuição dos grupos sanguíneos e suas bases moleculares na população brasileira
Achados moleculares na população brasileira ajudam a desenvolver protocolos mais seguros para genotipagem de grupos sanguíneos em nossos laboratórios
