Agilent 1100 纯化系统

1. Agilent 1100 纯化系统

2. 制备液相的操作 • 分析型液相与制备型液相的区别 • （半）制备液相方法的建立 • 制备液相操作技巧及注意事项 • Agilent 1100 样品纯化解决方案介绍 Agilent Restricted

3. 种类 柱内径 典型流速 开管液相色谱(纳流液相色谱) < 20 µm < 50 nL/min 毛细管液相色谱 0.1~ 1mm 1 ~100 µL/min 微孔液相色谱 1 ~2 mm 100 ~ 500 µL/min 小口径（窄口径）液相色谱 2 ~ 3 mm 500 ~ 1500 µL/min 常规液相色谱 3~5 mm 1.5 ~ 5 mL/min 半制备液相色谱 5~10 mm > 5 mL/min 制备液相色谱 > 10mm > 10 mL/min HPLC术语 Agilent Restricted

4. 高压制备 可使用与分析柱相同的细粒径填料，柱效高，组分分离度高； 分离重现性好； 节约分析时间及成本。 中/常压制备 只能使用较粗的填料，柱效低，对组分的分离度有限； 分离影响因素多（柱装填的均匀性，柱效，填料质量，流量稳定性及准确性等）； 时间消耗多。 高压制备与中/常压制备的比较 Agilent Restricted

5. 分析液相与制备液相的比较 • 制备型液相 • 目的:组分的分离纯化 • 半制备液相 • 流速较低 (< 10 ml/min) • 柱内径较小 (< 10 mm) • 制备液相 • 高流速 (> 10 ml/min) • 柱内径大 (> 10 mm) • 系统管线（0.5mm, I.d) • 低流速将导致更大的扩散 • 流通池光程 (3、0.3 或 0.06 mm) • 避免检测器的饱和，灵敏度降低，便于增加进样量 分析型液相 目的:组分的定性定量 低流速 (< 2 ml/min) 色谱柱内径小 (< 5 mm) 系统管路 (0.12～0.17 mm I.d) 流通池光程 (5~10 mm) Agilent Restricted

6. 纯化过程 溶剂提取 结晶 常压和/或中压色谱分离 复杂样品纯化 不同的组分群 N 目标组分达到一定含量及纯度要求 Y 高压制备分离纯化 Agilent Restricted

7. 1 优化分析方法: 对目标制备组分的分离度控制在 1.5～3之间 mAU 300 分离度 1.5 ~ 3 250 200 150 100 50 0 min 5 10 15 20 25 30 液相制备的工作步骤 Agilent Restricted

8. Vinj 样品分析 Vinj Vinj 体积过载 Vinj Vinj 浓度过载 在分析柱上进行过载试验 色谱柱的过载 2 Agilent Restricted

9. mAU 5000 4000 3000 2000 1000 0 分析柱上的过载试验 进样量 500 µg each 250 µg each 25 µg each 2.5 µg each 0.25 µg each 0.025 µg each 2 4 6 8 10 12 14 min Agilent Restricted

10.  制备放大的计算 分析柱： Zorbax SB-C18 3x150 mm, 5 µm 流速: 0.6 ml/min 进样量: 500 µg 制备柱: Zorbax SB-C18 21.2x150 mm, 5 µm 流速: ~30 ml/min 进样量:25 mg CL = 柱长比 = 1 V1 = 分析柱的流速= 0.6 ml/min x1 = 分析柱最大上样量= 500 µg r1 = 分析柱内径= 1.5 mm V2 = 制备柱的流速＝？ x2 = 制备柱最大上样量=? r2 = 制备柱内径=10.6mm Agilent Restricted

11. mAU 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 10 min  制备放大试验 Agilent Restricted

12. 影响硅胶填料反相色谱柱性能的参数 • 硅胶类型： 不定形硅胶，球形硅胶柱容量，充填均匀度 • 硅胶纯度： 金属含量，填料酸性峰形 • 填料颗粒尺寸：粒径大小分布，均匀度充填均匀度，流速相关性 • 填料孔径： 7～12nm，30nm适用的化合物分子量范围 • 键合密度： 含碳量容量因子，保留时间 • 键合方式：键合相修饰 选择性，水性流动相的耐受性 • 柱填料量：柱床实密性 柱容量 • 封端技术： 屏蔽硅醇基， 碱性化合物的峰形，选择性 • 消除二次化学平衡效应 因此，并非所有C18柱都相同， 分析柱和制备柱应选择相同的填料！！

13. 产量：进样量， 组分收集参数设定 浓度，体积，样品溶解性能，组分含量，回收率，柱容量 10 min 产量 纯度：分离度 柱效，进样量，分离条件 通量：分析时间 分离条件，样品复杂程度 通量 纯度 30 min 6 min 制备参数的关系 Agilent Restricted

14. 制备产率 产量＝样品浓度进样体积组分含量收集回收率累积次数 样品浓度：化合物的溶解性能（溶剂、温度、样品纯度等） 进样体积：柱容量，流通池设计 收集回收率：分离条件，组分收集触发参数的设定 累积次数：分析时间，容器的容量 可使用3.0~50mm内径的色谱柱，分析和制备在同一套系统上完成，便于方法的建立和转换；每次进样“产量”与多种因素相关，用户可通过多次进样，以及累积收集功能，获得纯度及产率满意的纯化合物。 Agilent Restricted

15. mAU 高压混合梯度 低压混合梯度 1000 800 滞后时间 600 400 延迟体积：二元泵 400uL 四元泵 1000uL 梯度起点 200 0 0 5 10 15 20 25 min 梯度延迟体积 建议：测定不同系统的延迟体积，并通过调节梯度的起始时间，以便在不同仪器上获得重现的色谱图 Vdelay=Vmixer+Vpre-column

16. 梯度曲线 1100 制备泵 1600 5 1400 2 1200 3 1000 4 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 min 相对延迟 2 梯度曲线 1200 其它制备泵 3 1000 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 min 柱前延迟体积的影响 因此，在不同系统之间进行方法转换，需分别测定系统延迟体积 Agilent Restricted

17. UV检测器 MS检测器 组分收集器 柱后延迟体积对自动组分收集的影响 由于管线连接的不同长度，流分到达组分收集器的时间将与信号被检测的时间（保留时间）存在不同的滞后，如果根据保留时间收集将导致组分收集的错误甚至缺失，因此，进行延迟体积的校正是非常必要的。 Agilent Restricted

18. 延迟体积的自动计算及校正 Calc Delay Vol. 384L Agilent Restricted

19. mAU 4.244 4.800 2500 254nm 2000 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4 5 6 min mAU 4.242 4.820 205nm 2000 3.276 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4 5 6 min 检测波长影响 严重干扰组分纯度及产率 波长选择不当 分离度 组分交叉收集 Agilent Restricted

20. mAU 6.423 7.168 2500 分析柱：Zorbax XDB C18 4.6250mm 进样量：10mg/mL150 L Inj. 10mg/mL, 150uL 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 10 min mAU 4.244 4.800 2500 制备柱：Zorbax XDB C18 21.2150mm 进样量：40mg/mL400 L 254nm 2000 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4 5 6 min 用户应用实例 分析进样量：1.5mg 理论计算 制备进样量：20mg 或相同浓度进样体积：2mL 溶解度及进样体积限制 每次进样16mg Agilent Restricted

21. 样品纯化技巧以及注意事项 • 尽量采用浓度过载方式上样：有利于防止因样品在柱头扩散而降低柱效； • 所有连接管线，尤其柱后管线尽可能短，避免不必要的峰扩散，影响收集效率； • 采用装填细粒径填料的制备柱（7m或5m ），保证良好的柱效，高分离效能，缩短分析时间； • 准确设定组分收集的触发参数，避免因收集位点的偏移影响组分纯度及产率； • 采用高质量的溶剂作为流动相：防止溶剂中带入不可知的杂质； • 注意所有容器的洁净度，防止不可预知的杂质污染。 Agilent Restricted