PNRF-104-AI-1/07

1. Ochrona przed zwyrodnieniem układu nerwowego: rola peptydów endogennych, L-argininy i kwasów tłuszczowych jako potencjalnych czynników modulujących czynność mitochondriów, zwiększających żywotność mózgu poddanego działaniu bodźców stresowych. PNRF-104-AI-1/07

2. Jednostki realizujące projekt: Uniwersytet Jagielloński, Colegium Medicum, Wydział Lekarski Team Leader: Prof. Aldona Dembinska-Kieć School of Pharmacy, University of Oslo Team leader: Prof. Arild C. Rustan Department of Nutrition Institute of Basic Medical Sciences University of Oslo Team leader: Prof. Rune Blomhoff Institute of Medicine, Section of Medical Biochemistry, University of Bergen Team leader: Prof. Rolf K. Berge

3. Wstęp Choroba Alzheimera jest jedną z najbardziej powszechnych chorób neurodegeneracyjnych, dotykającą starzejące się społeczeństwo. Jest to forma demencji o złożonej etiologii, prowadząca do postępującej utraty zdolności poznawczych oraz umiejętności uczenia się. Jedną z głównych neuropatologicznych cech choroby Alzheimera jest degeneracja mitochondrów i apoptoza komórek na skutek akumulacji białka beta-amyloidu.

4. Cel projektu Celem projektu jest badanie nowych potencjalnych możliwości terapii i mechanizmów neuroprotekcji, przy użyciu peptydów humaninowych, L-argininy i substratów energetycznych, mających zdolność modulowania i podtrzymywania funkcji mitochondriów.

5. Przeprowadzenie badań Naukowcy wchodzący w skład konsorcjum badali metaboliczne mechanizmy działania antyapoptotycznego i neuroprotekcyjnego peptydów humaninowych, oraz innych związków bioaktywnych, takich jak L-arginina i kwasy tłuszczowe na modelach komórek (gleju, śródbłonka) narażonych na czynniki prozapalne i proapoptotyczne. Badania były prowadzone również na modelach zwierzęcych, obejmujących myszy reporterowe NF-kappa beta-lucyferaza, oraz myszy transgeniczne o zwiększonej ekspresji TNF-alfa.

6. Metody badawcze Badania metabolizmu komórkowego: - metabolizm mitochondrialny (substraty: glukoza i kwas palmitynowy) - potencjał błony mitochondrialnej Bioimiger (BD), cytometria - potencjał energetyczny mitochondriów – elektroda tlenowa - generacja ATP w mitochondriach Badania ekspresji genów metodą mikromacierzy: badania przesiewowe na macierzach Affimetrix i Agilent badania wybranego szlaku (apoptozy) na macierzy TLDA (w oparciu o real-time PCR 7900 HT TaqMan Applied Biosystems Badania czynnościowe na zwierzętach

7. Wyniki Pomiar potencjału błony mitochondrialnej(BD Bioimager 855 microscopy) ■ ß-amyloid istotnie statystycznie obniża  w komórkach LN-18, Daoy oraz w mysich astrocytach C8-D1A ■TNF-αobniża w ludzkich komórkach endotelialnych wyizolowanych z żyły pępowinowej HUVEC ■Peptydy humaniny nie wpływają na toksyczny efekt wywołany ß-amyloidem z wyjątkiem  HNM i 13IleHN10b, które obniżają  we wszystkich analizowanych typach komórek. Pomiar potencjału błony mitochondrialnej (fluocytometr przepływowy BD Canto II) Pomiar funkcji energetycznej mitochondriów(elektroda tlenowrażliwa Oxygraph-2k OROBOROS) ■Wybrane peptydy humaniny, kwasy tłuszczowe oraz L-arginina nie wpływają znacząco na proces oddychania mitochondrialnego w komórkach LN18, Daoy, C8-D1A oraz HUVEC. ■ ß-amyloid obniża generację ATP w kom. LN-18, Daoy oraz w C8-D1A. ■TNF-αnie wplywa na generację ATP w kom. HUVEC. ■ peptydy humaniny nie wykazują protekcyjnego działania w procesie generacji ATP we wszystkich analizowanych liniach komórkowych. ■Zaobserwowano obniżenie generacji ATP po inkubacji z EPA and TTA w kom. HUVEC poddanych działaniuTNF-α L-arginina nie wplywa na generację ATP w analizowanych typach komórek Pomiar generacji ATP(metoda luminescencji z wykorzystaniem kitu: ATP Lite,Parkin Elmer Kit)

8. Regulacja genów apoptozy na modelach komórkowych

9. Regulacja genów apoptozy na modelu myszy reporterowych NF-kappa - beta-lucyferaza

10. Testy czynnościowe

11. Podsumowanie • Na modelach komórkowych wykazano, że badane peptydy humaninowe oraz inne badane związki bioaktywne (kwasy tłuszczowe) mają znaczenie neuroprotekcyjne uczestnicząc w regulacji nie tylko procesu apoptozy ale również procesu zapalnego. • Wstępna analiza wyników ekspresji genów metodą mikromacierzy, uzyskanych w doświadczeniach na zwierzętach, prowadzonych we współpracy z partnerami z Norwegii wydaje się potwierdzać te wyniki. • W wyniku realizacji projektu opublikowano 4 publikacje, 32 streszczenia na konferencje międzynarodowe. Przygotowywane są kolejne manuskrypty prac do druku.