Физическая химия биополимеров Лаврик О.И.

1. Физическая химия биополимеров Лаврик О.И. НГУ-2012

2. 3. Стационарная кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен. Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса (KM, Vmax). Значение параметра kcat/KM. Порядок величин. Методы их определения

3. Стационарная кинетика ферментативныхреакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен E << S v = при [S]<<KMv=[E0][S](kcat/KM)

4. Леонор Михаэлис 1875—1949 Берлин, Германия - Нью-Йорк, США биохимик и химик-органик Мауд Леонора Ментен 1879 – 1960,Канада биохимик и физиолог

5. Интерпретация кинетических параметров для односубстратных реакций: механизм Михаэлиса-Ментен V kcat kcat V

6. Последующие модификации механизма Михаэлиса-Ментен1) Механизм Бриггса-Холдейна (КM>KS)

7. Промежуточное соединение, образующееся вслед за образованием ES: КM<KS Если в ходе реакции происходит образование дополнительных ковалентно или нековалентно связанных промежуточных соединений, уравнение Михаэлиса-Ментен применимо при медленной конечной каталитической стадии и КM<KS, хотя теперь KM и kcatпредставляют собой комбинацию различных констант скорости и констант равновесия: [ES΄]=K΄[ES], [ES΄΄]=K΄΄[ES΄]. KM= KS/(1+K΄+K΄K΄΄) kcat= k4K΄K΄΄(1+K΄+ K΄K΄΄)

8. Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса-Ментен А) Константа kcat Параметр kcat – число оборотов фермента, определяет максимальное число молекул субстрата, превращающихся в продукт одним активным центром в единицу времени при насыщении - В том случае, когда имеется один фермент-субстратный комплекс и все стадии связывания достаточно быстрые, kcat – константа скорости первого порядка для превращения комплекса ES в комплекс ЕР. • В более сложных случаях kcat – функция всех констант скорости первого порядка. Например, для механизма, когда комплекс ЕР диссоциирует достаточно быстро, kcat=k2: • Для следующей схемы kcat является функцией констант k2 и k3 (kcat= k2k3/(k2+k3)): Однако, если одна из этих констант много меньше другой, kcat становится равной меньшей константе. Например, если k3<k2, то kcat=k3. Из этого следует, что kcat не может превышать ни одной из констант скорости первого порядка для реакционного пути в прямом направлении и представляет собой, таким образом, нижний предел для констант скорости химических реакций.

9. Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса-Ментен Б) Величина KM KM=KS для простого механизма Михаэлиса-Ментен. В некоторых других случаях: KM= где ∑[ES] – сумма концентраций всех фермент-содержащих форм. Для механизма действия химотрипсина: [ES΄] = [ES]k2/k3 При k2>>k3, [ES΄]>>[ES], и [ES΄] вносит в величину KM больший вклад, чем [ES], являясь преобладающей ферментсодержащей формой. KMменьше KS приблизительно в k3/k2 раз: KM≈KS(k3/k2)

10. Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса-Ментен В) Параметр kcat/KM • Отношение kcat/KM не может превышать ни одну из констант скорости второго порядка для последовательности реакций, идущих в прямом направлении, и представляет собой нижний предел для константы скорости при связывании фермента с субстратом. • Скорость реакции при низких концентрациях субстрата определяется уравнением v=(kcat/KM)[E]0[S], т.е. отношение kcat/KM представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка. Этот параметр не является истинной микроскопической константой, за исключением крайнего случая, когда реакция лимитируется столкновением фермента с субстратом. • Параметр kcat/KM связывает скорость реакции с концентрацией свободного фермента, а не с его общей концентрацией. При низкой концентрации субстрата фермент находится преимущественно в свободном состоянии ([Е]≈[Е]0), и, следовательно, скорость реакции есть v=(kcat/KM)[E][S].

11. Графическое представление данных

12. 1. График Лайнуивера-Берка

13. 2. График Эдди-Хофсти v = Vmax - vKM/[S]

14. 3. График зависимости Vmax от KM Vmax = v + KMv/[S]