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GeneXpert MTB/RIF

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GeneXpert MTB/RIF - PowerPoint PPT Presentation


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GeneXpert MTB/RIF. GeneXpert MTB/RIF. teste que utiliza a plataforma GeneXpert (Cepheid) permite a detecção de resistência a rifampicina (mutações no gene rpoB) baseado na técnica de PCR em tempo real. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

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Presentation Transcript
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GeneXpert MTB/RIF

  • teste que utiliza a plataforma GeneXpert (Cepheid)
  • permite a detecção de resistência a rifampicina (mutações no gene rpoB)
  • baseado na técnica de PCR em tempo real
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Reação em Cadeia da Polimerase(PCR)

  • Um das principais ferramentas de biologia molecular
  • Desenvolvidapor Kary Mullis em 1983, resultando no prêmio Nobel em Química
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Melting

100

94 oC

Temperatura

50

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T e m p o

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PCR
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Melting

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Temperatura

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PCR

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Melting

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Extensão

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Temperatura

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PCR
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Melting

Melting

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94 oC

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Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

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T e m p o

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5’

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PCR

94ºC

94ºC

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Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

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T e m p o

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3’

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5’

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PCR
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Melting

Melting

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94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

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T e m p o

5’

5’

5’

5’

PCR

94ºC

94ºC

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Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

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T e m p o

5’

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5’

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PCR
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30x

Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

0

T e m p o

5’

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5’

Fragmentos de tamanho definido

5’

5’

5’

5’

5’

PCR
mais ciclos mais dna
Mais Ciclos = Mais DNA

Número de ciclos

0 10 15 20 25 30

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Amplificação

30 ciclos geram aproximadamente 109 moléculas

Permite aumentar a quantidade

de uma determinada amostra

Pode aumentar a quantidade

de um contaminante

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DNA polimerase de E. coli

  • Klenow (derivada da DNA Pol.I de E.coli)

extensão

desnaturação

anelamento

  • DESVANTAGENS: Temperatura ótima baixa e não é termoestável
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Breve Histórico

• O primeiro termociclador foi desenvolvido

na Cetus Corp. – Mr Cycle

• Projetado para que a DNA polimerase

pudesse ser adicionada a cada ciclo

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DNA Polimerase Termoestável

• 1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a descoberta de uma nova espécie de bactéria – Thermus aquaticus – sobrevive na água a temperatura média de 75ºC

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• Várias enzimas isoladas desse microorganismo

incluindo a primeira DNA polimerase termoestável

Taq DNA polimerase (1976)

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Taq DNA polimerase – temperatura ótima de 72ºC e é estável até temperaturas superiores a 94ºC

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Kary Mullis

Prêmio Nobel de Química em 1993

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Componentes de uma reação de PCR

1. Template (molde) (1–500 ng).

2. Primers (0.05–1.0 μM).

3. Mg2+ (0.5–5 mM).

4. dNTP (20–200 μMcada).

5. 1× PCR buffer

6. DNA polimerase (0.5–2.5 U para cada 50 μL de reação).

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PCR “padrão”

  • Permite amplificar uma determinada seqüência de DNA
    • Clonagem gênica
    • Sonda (northern blot, southern blot, hibridização in situ,...)
    • Seqüênciamento (identificação de amostra, análise filogenética, confirmação de transfecção)
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GeneXpert

(Cepheid)

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GeneXpert

(Cepheid)

diagn stico laboratorial da tuberculose
Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose
  • Métodos bacteriológicos . Métodos Moleculares

-Baciloscopia -24hs - Fita Hain 3 dias ou mais

(baciloscopia positiva +)

-Cultivo – MGIT – 10 dias

- Genexpert -2hrs

- Sólido – 30 dias

- Teste de Sensibilidade

- MGIT -15 dias

- Método das Proporções 28 a 42 dias

diagn stico laboratorial da tuberculose1
Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose

Vantagens e Desvantagens

-Bacteriológico - Moleculares(Genexpert)

- Mais barato - Mais caro

(baciloscopia)

- TSA Mais demorado (MGIT) - Mais rápido Rif resit

- Outras drogas (INH, etc.) - Só para Rif

- Bacilos vivos - Bacilos Vivos e “mortos”

- Cultivar para TSA confirmatório

e outras drogas (quantidade de

escarro)

- Triagem

- Três códons relacionados a resistência a RIF

- Não detecta em amostras extra-pulmonares

- Não detecata MNT

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