GeneXpert MTB/RIF
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GeneXpert MTB/RIF. GeneXpert MTB/RIF. teste que utiliza a plataforma GeneXpert (Cepheid) permite a detecção de resistência a rifampicina (mutações no gene rpoB) baseado na técnica de PCR em tempo real. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

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Presentation Transcript

GeneXpert MTB/RIF

  • teste que utiliza a plataforma GeneXpert (Cepheid)

  • permite a detecção de resistência a rifampicina (mutações no gene rpoB)

  • baseado na técnica de PCR em tempo real


Reação em Cadeia da Polimerase(PCR)

  • Um das principais ferramentas de biologia molecular

  • Desenvolvidapor Kary Mullis em 1983, resultando no prêmio Nobel em Química



Melting

100

94 oC

Temperatura

50

0

T e m p o

3’

5’

5’

3’

PCR


Melting

100

94 oC

Temperatura

50

0

T e m p o

3’

5’

PCR

94ºC

5’

3’


Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

0

T e m p o

5’

3’

5’

5’

5’

3’

PCR


30x

Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

0

T e m p o

5’

3’

5’

5’

5’

3’

PCR

94ºC

94ºC


30x

Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

0

T e m p o

5’

3’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

PCR


30x

Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

0

T e m p o

5’

5’

5’

5’

PCR

94ºC

94ºC


30x

Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

0

T e m p o

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

PCR


30x

Melting

Melting

100

94 oC

94 oC

Extensão

Anelamento

Temperatura

72 oC

50 oC

50

0

T e m p o

5’

5’

5’

Fragmentos de tamanho definido

5’

5’

5’

5’

5’

PCR


Mais ciclos mais dna
Mais Ciclos = Mais DNA

Número de ciclos

0 10 15 20 25 30


Amplificação

30 ciclos geram aproximadamente 109 moléculas

Permite aumentar a quantidade

de uma determinada amostra

Pode aumentar a quantidade

de um contaminante


DNA polimerase de E. coli

  • Klenow (derivada da DNA Pol.I de E.coli)

extensão

desnaturação

anelamento

  • DESVANTAGENS: Temperatura ótima baixa e não é termoestável


Breve Histórico

• O primeiro termociclador foi desenvolvido

na Cetus Corp. – Mr Cycle

• Projetado para que a DNA polimerase

pudesse ser adicionada a cada ciclo



DNA Polimerase Termoestável

• 1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a descoberta de uma nova espécie de bactéria – Thermus aquaticus – sobrevive na água a temperatura média de 75ºC


• Várias enzimas isoladas desse microorganismo

incluindo a primeira DNA polimerase termoestável

Taq DNA polimerase (1976)


Taq DNA polimerase – temperatura ótima de 72ºC e é estável até temperaturas superiores a 94ºC


Kary Mullis

Prêmio Nobel de Química em 1993


Componentes de uma reação de PCR

1. Template (molde) (1–500 ng).

2. Primers (0.05–1.0 μM).

3. Mg2+ (0.5–5 mM).

4. dNTP (20–200 μMcada).

5. 1× PCR buffer

6. DNA polimerase (0.5–2.5 U para cada 50 μL de reação).


PCR “padrão”

  • Permite amplificar uma determinada seqüência de DNA

    • Clonagem gênica

    • Sonda (northern blot, southern blot, hibridização in situ,...)

    • Seqüênciamento (identificação de amostra, análise filogenética, confirmação de transfecção)



GeneXpert

(Cepheid)


GeneXpert

(Cepheid)

















Diagn stico laboratorial da tuberculose
Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose

  • Métodos bacteriológicos . Métodos Moleculares

    -Baciloscopia -24hs - Fita Hain 3 dias ou mais

    (baciloscopia positiva +)

    -Cultivo – MGIT – 10 dias

    - Genexpert -2hrs

    - Sólido – 30 dias

    - Teste de Sensibilidade

    - MGIT -15 dias

    - Método das Proporções 28 a 42 dias


Diagn stico laboratorial da tuberculose1
Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose

Vantagens e Desvantagens

-Bacteriológico - Moleculares(Genexpert)

- Mais barato - Mais caro

(baciloscopia)

- TSA Mais demorado (MGIT) - Mais rápido Rif resit

- Outras drogas (INH, etc.) - Só para Rif

- Bacilos vivos - Bacilos Vivos e “mortos”

- Cultivar para TSA confirmatório

e outras drogas (quantidade de

escarro)

- Triagem

- Três códons relacionados a resistência a RIF

- Não detecta em amostras extra-pulmonares

- Não detecata MNT


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