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实验五、 PCR 扩增 16SrDNA

实验五、 PCR 扩增 16SrDNA. 一、实验原理. 1 、 PCR. 多聚酶链式反应 (polymerase chain reaction) 简称PCR技术,是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。此法操作简便, 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的DNA序列的拷贝,PCR技术虽然问世仅数年时间, 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域,引起了生物技术发展的一次革命,目前它在分子克隆, 目的基础检测,遗传病的基因诊断,法医学,考古学等方面得到了广泛的应用。.

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实验五、 PCR 扩增 16SrDNA

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  1. 实验五、PCR扩增16SrDNA 一、实验原理 1、PCR • 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR技术,是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。此法操作简便, 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的DNA序列的拷贝,PCR技术虽然问世仅数年时间, 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域,引起了生物技术发展的一次革命,目前它在分子克隆, 目的基础检测,遗传病的基因诊断,法医学,考古学等方面得到了广泛的应用。

  2. PCR技术实际上是模拟体内DNA合成过程,是在模板DNA, 引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合反应,PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 反应分三步:①变性(denaturation);②退火(annealing);③延伸(ex tension),反应过程见图。

  3. PCR(Polymerase Chain Reaction) 的原理

  4. 一、实验原理 2、 16SrDNA的核酸序列分析 16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因,是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。 16SrRNA的序列高度保守,可精确指示细菌之间的亲缘关系,16SrRNA的大小为1500bp左右,所含信息能反映生物界进化关系,易操作,适用于各级分类单元。 目前常用的是建立在PCR技术基础上的16SrRNA基因的直接测序法,方便快捷。

  5. 较之23SrDNA等看家基因而异,它具有分子大小适中,突变率小等优点,素有“细菌化石”之称。较之23SrDNA等看家基因而异,它具有分子大小适中,突变率小等优点,素有“细菌化石”之称。 其序列包含10个可变区(variable region)和与之相同的11个恒定区(constant region),可变区因细菌而异,且变异程度与细菌的系统发育密切相关。

  6. 二、PCR标准反应体系 • DNA模板 • 引物 • 反应缓冲液 • dNTP • ddH2O • 耐热聚合酶

  7. 二、PCR标准反应体系 • 1.DNA模板:反应中DNA量在50ng~200ng左右。且DNA纯度较高, 以增加反应特异性。 • 2.dNTP:反应体系中达100μM~200μM。 • 3.Mg2+:Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右,浓度太低Taq酶活力降低;太高反应特异性降低。 • 4.引物:根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右;G+C含量在40 %-70%之间;引物内部不能有回该序列;引物3’端不能互补。 • 5.Taq酶:它是从嗜热杆菌中提取的耐热性DNA聚合酶,在95℃时30分钟还有50%活力。

  8. 二、PCR标准反应体系 • 6.变性温度:在93~95℃之间使模板充分变性。 • 7.复性温度:55℃左右,此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定, 它是反应特异性的决定因素。 • 8.延伸温度:70~72℃左右,为Taq酶最适反应温度。

  9. PCR法的操作过程 Step 1:DNA热变性 Step 2:引物退火 Step 3:引物延伸

  10. 例如: • 模板DNA在94℃条件下变性形成单链; 在55℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合;70℃下在耐热性DNA聚合酶Taq 酶催化下, 在4种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成的DNA为模板进行同样反应,如次往复循环30次,由于每次循环目标DNA都以2n次幂扩增,30次循环后目的DNA的量增加106-7倍。成功的PCR反应要求反应有很好的特异性,和相当的扩增效率。

  11. 三、反应体系对PCR扩增的影响 • 纯度:蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 • 完整性:模板降解会导致PCR扩增无产物 • 浓度: 加量过多导致非特异性扩增增加 • 特异性:长度适当、避免二级结构和二聚体 • 完整性:避免反复冻融 • 浓度:应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少 DNA模板 引 物

  12. 三、反应体系对PCR扩增的影响 • pH值,盐离子浓度 • 稳定剂,增强剂 反应Buffer • 过高非特异性严重 • 过低无扩增产物 Mg 2+浓度 • 浓度适当 • 避免反复冻融 dNTP Mixture • pH值适当 • 避免污染 ddH2O

  13. 四、材料、设备及试剂 设备 :eppendorf管、微量取液器, 台式 高速离心机, 电泳仪、 电泳槽、UVP凝胶成像系统、PCR仪 试剂:16SrDNA引物、细菌基因组DNA、Taq Plus、dNTP、 PCR 反应缓冲液、琼脂糖 、TAE电极缓冲液、 Lamdar DNA/HindⅢ 、EB 、 加样缓冲液

  14. 五、操作步骤 (一)、PCR反应 1. 依次混匀下列试剂 5μl 10×PCR反应缓冲液 1μl 4种dNTP 2μl 上游引物(引物1) 2μl 下游引物(引物2) 1μl 模板DNA 0.5μl Taq DNA聚合酶 38.5μl H2O 混匀后离心5秒。 (二)扩增:用94℃变性3分钟, 94℃变性1分钟,61℃退火1分钟, 72℃延伸1分钟, 循环30轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下最后延伸5分钟,使反应产物扩增充分。 (三)电泳鉴定:方法同实验二(2%琼脂糖凝胶) 实验结果:分析PCR产物电泳结果

  15. 六、PCR常见问题分析 问题一:无扩增产物 • 现象:正对照有条带,而样品则无; 原因 • 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 • 更换Buffer或调整浓度 • 重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物 • 降低退火温度、延长延伸时间 • 模板:含有抑制物,含量低 • Buffer对样品不合适 • 引物设计不当或者发生降解 • 反应条件:退火温度太高,延伸时间太短 对 策

  16. 六、PCR常见问题分析 问题二:非特异性扩增 • 现象:PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

  17. 问题二:非特异性扩增 原因 • 重新设计引物或者使用巢式PCR • 适当降低模板或引物浓度 • 适当减少酶量 • 降低镁离子浓度 • 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 • 减少循环次数 • 引物特异性差 • 模板或引物浓度过高 • 酶量过多 • Mg2+浓度偏高 • 退火温度偏低 • 循环次数过多 对 策

  18. M 1 2 六、PCR常见问题分析 问题三:拖尾 • 现象:产物在凝胶上呈Smear状态。

  19. 问题三:拖尾 原因 • 模板不纯 • Buffer不合适 • 退火温度偏低 • 酶量过多 • dNTP、Mg2+浓度偏高 • 循环次数过多 • 纯化模板 • 更换Buffer • 适当提高退火温度 • 适量用酶 • 适当降低dNTP和镁离子的浓度 • 减少循环次数 对 策

  20. 六、PCR常见问题分析 问题四:假阳性(筛选转基因、检测基因表达情况) • 现象:空白对照出现目的扩增产物 原因 操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外; 除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存。 对 策 • 靶序列或扩增产物的交叉污染

  21. 七、问题与讨论 1、简述PCR基本原理 2、进行一次成功的PCR反应顺注意哪些问题。 3、谈谈你对基因工程实验课程的想法与建议。

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