实验九 免疫学检测技术临床应用综合训练 ---- 自身免疫性疾病的检测

1. 实验九 免疫学检测技术临床应用综合训练 ----自身免疫性疾病的检测

2. 一、实验目的要求 1.掌握自身免疫性疾病免疫检测的应用原则。 2.了解SLE疾病特点，掌握SLE免疫学特征及常用检测项目。 3.掌握ANA荧光抗体技术原理、方法和检测意义。 4.掌握ENA多肽抗体谱检测技术原理、方法和检测意义。 5.掌握抗dsDNA抗体免疫渗滤试验原理、方法和检测意义。 6.掌握RF胶乳凝集试验的原理、方法和检测意义。 7.掌握免疫标记技术试验原理、实验方法及结果判断。 8.掌握化学发光、流式细胞仪的测定原理，熟悉化学发光、流式细胞仪临床检测的意义。 9.掌握组织配型的原理、方法及应用。

3. 二、 相关知识回顾 1. Ag 机体 特异性免疫应答 无免疫应答 免疫应答过强 自身Ag ？ 正常情况下，免疫系统对宿主自身的组织和细胞 不产生免疫应答，即自身免疫耐受。

4. 2.在某些情况下，自身耐受遭到削弱或破坏，机体免疫系统针对自身抗原产生免疫应答，体内检出自身抗体或自身反应性T淋巴细胞，这种现象称为自身免疫。2.在某些情况下，自身耐受遭到削弱或破坏，机体免疫系统针对自身抗原产生免疫应答，体内检出自身抗体或自身反应性T淋巴细胞，这种现象称为自身免疫。 • 微弱的自身免疫并不引起机体的病理性损伤，而促进体内衰老残疾细胞的清除，帮助吞噬细胞完成免疫自稳效应，以保持机体生命环境的稳定。 • 在许多正常人血清中可发现多处微量的自身抗体或致敏淋巴细胞，自身免疫现象随年龄递增而愈加明显，在70％以上的正常老年人血清中可查出自身抗体。

5. 3. 当某种原因使自身免疫应答过分强烈时，可导致相应的自身组织器官损伤或功能障碍，使机体处于疾病状态，即自身免疫性疾病。 按自身抗原分布范围分类： • 器官特异性：自身抗原为某一器官的特定成分，其病变常局限于该器官。 • 非器官特异性：自身抗原是非器官组织特异的，是多器官、组织的共有成分。

8. 4.AID的共同特征 • 多数病因不清，无诱因者称为“自发”或“特发” • 女性居多，随年龄增加发病率上升 • 有遗传倾向 • 血清中有自身抗体或针对自身组织细胞的致敏淋巴细胞，自身抗体在不同的自身免疫疾病中有交叉重叠现象。 • 疾病的重叠现象，即同一病人可同时患一种以上AID • 病程慢性迁移，反复发作 • 病损局部有淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞浸润 • 免疫抑制剂治疗有一定疗效

9. 5. AID的发病机制 自身组织成分 自身抗体 致敏淋巴细胞 自身免疫应答 自身组织细胞损伤

10. （一）由II型超敏反应引起的免疫损伤 （二）由III型超敏反应引起的免疫损伤 （三）T细胞对自身抗原应答引起的免疫损伤

14. 6. 常见的AID （一）由II型超敏反应引起的AID 抗血细胞表面抗原抗体引起的自身免疫病 如：自身免疫性溶血性贫血 免疫性血小板减少性紫癜 抗细胞表面受体抗体引起的自身免疫病 如：重症肌无力 毒性弥漫性甲状腺肿 细胞外抗原的自身抗体引起的自身免疫病 如：肺出血肾炎综合症

15. （1）自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia,AIHA） 红细胞+药物 → 表面抗原性发生变化 → 产生抗红细胞表面抗原的自身抗体+表面抗原→激活补体→破坏红细胞 特点： • 体内出现抗红细胞自身抗体，Coombs test阳性； • 红细胞寿命缩短；

16. （2）免疫性血小板减少性紫癜（immunologic thrombocytopenic purpura,ITP） 主要表现： • 皮肤粘膜紫癜，plt↓,骨髓中巨核细胞可增多。 • 女性多发，发病率1/10000。患者有抗血小板抗体，其使plt寿命缩短。 • 可分为特发性和继发性。

17. (二)由Ⅲ型超敏反应引起的自身免疫性疾病 • 系统性红斑狼疮（SLE）； • 类风湿性关节炎（RA） 。 （三）由T细胞对自身抗原应答引起的自身免疫性疾病 • I型糖尿病（DM1） • 多发性硬化症（MS）

18. （1）SLE：一种病因未明的自身免疫介导的炎症性结缔组织病。体内有大量自身抗体和免疫复合物，造成组织损伤，临床上可出现各个系统和脏器损害的症状。（1）SLE：一种病因未明的自身免疫介导的炎症性结缔组织病。体内有大量自身抗体和免疫复合物，造成组织损伤，临床上可出现各个系统和脏器损害的症状。 • 免疫学特征： • 存在多种抗核抗体； • 存在多种其他自身抗体； • 血清补体水平↓,Ig和补体沉积在肾和皮肤-表皮交界处； • 遗传风险因子包括补体经典途径早期阶段成分的缺陷。

19. 主要的自身抗体有： • 抗核抗体——筛选指标 抗Sm抗体——标志抗体 抗dsDNA抗体——特异性抗体 • 抗DNA抗体 抗ssDNA－－非特异性抗体 • 抗磷脂抗体 10%～15%SLE患者，与梅毒假阳性有关。

20. 抗血小板抗体（75%～80%） 抗血小板Ⅷ因子抗体——出血 抗血小板抗体——血小板减少 • 抗红细胞抗体（10%～60%） 直接Coombs试验 • RF（30%） 胶乳凝集试验 • 抗细胞质抗体 抗线粒体抗体、抗核糖体抗体、抗溶酶体抗体

21. （2）RA：是一种累及周围关节为主的多系统性自身免疫病。病理改变以关节滑膜慢性炎症性增生、关节软骨和骨质进行性不可逆破坏为特征。 • 免疫学特征： • 血液和滑膜液中存在RF； • 淋巴细胞和活化的巨噬细胞浸润到受累滑液； • 炎症滑液局部产生TNFα等其他炎症前细胞因子。 • 主要的自身抗体有： • 1）RF－－非特异性，过筛实验，和疾病预后相关 • 2）抗核抗体（低滴度） • 3）抗胶原酶抗体等

22. 7. AID的免疫检测原则 • 筛查性试验与确诊性试验项目的合理组合 • 选择相关的自身抗体检测项目 • 切忌盲目的全面检测 • 实验中应同步设置阳性和阴性对照 • 一般ANA筛选；结合IgG、IgA、IgM、补体（CH50或C3）、RF的检测结果； • 结果异常，再检测ENA、dsDNA等

23. 95%～99%可排除SLE （－） SLE治疗缓解 病情特重（大量IC沉积消耗抗体） （＋）低滴度 常见于RA等其它自身免疫性疾病 　　　高滴度　可作为诊断SLE的依据 ENA抗体谱检测 （－）不能排除 抗dsDNA、Sm、rib抗体 （＋）可帮助诊断　 ANA初筛

24. 免疫球蛋白及补体检测 • （1）免疫球蛋白检测意义 • 自身抗体↑→Ig↑→其中IgG↑明显，IgM、IgA亦↑ • Ig含量波动与疾病活动与稳定有相关性 • （2）补体检测意义 • Ⅱ、Ⅲ型变态反应性机制所致的AID补体消耗↑→故含量↓（疾病缓解补体可恢复正常，补体的变化可了解疾病的进展） • 自身反应性T淋巴细胞引起的AID补体无明显变化

25. 8.抗核抗体：以真核细胞（如HEp-2细胞、肝细胞）的8.抗核抗体：以真核细胞（如HEp-2细胞、肝细胞）的 各种细胞核成分为靶抗原所检测的自身抗体的总称。

26. 9. 抗核抗体检测方法 间接免疫荧光法 （indirect immunofluorescence, IIF） 酶免疫斑点法 ELISA 免疫印迹法 （Western-blot）

27. 10. 荧光免疫技术 将抗原抗体反应的特异性和荧光物质检测的直观性和敏感性结合起来的一种免疫分析技术。 免疫组化技术（荧光抗体技术） 均相——荧光偏振免疫测定 （FPIA） 荧光免疫测定 非均相——时间分辨荧光免 疫分析（TR-FIA）

28. 11. 荧光和荧光物质 1）荧光的产生： 物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。 由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ------荧光免疫技术 由化学反应所引起的荧光，为化学荧光 ------化学发光技术

29. 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图

30. 2）常见荧光素的特性：

31. 11. 免疫荧光显微镜技术 • 原理 以荧光显微镜为检测工具，用荧光素标记特异性抗体或抗抗体，检测固定组织细胞上的抗原或血清中的抗体，常用于定性和定位检查的一门技术。 • 优点：可定位、定性检测，直观性强 • 缺点：难以保存，非特异荧光干扰

32. 方法： 1） 直接法：

33. 2）间接法

34. 3） 补体法

35. 4）双标记法 • 用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一标本进行荧光染色。

36. 应用 • 细菌学方面：菌种鉴定和Ag结构的研究 • 病毒学方面：病毒鉴定和病毒在感染cell内的定位 • 免疫学方面： • 1）研究 • 2）用于自身免疫病的诊断 • 3）T、B细胞亚群的分离及检测 • 寄生虫学方面：用于寄生虫的诊断 • 其它：激素或酶的组织定位

37. 荧光显微镜

41. 抗双链DNA抗体 12. 抗双链DNA抗体检测 • 抗dsDNA抗体与细胞核DNA（外围区）脱氧核糖磷酸框架结合。 • 抗dsDNA抗体是SLE患者的特征性标志抗体。其抗体滴度与疾病的活动程度有相关性。

42. 方法：斑点金免疫渗滤试验 • 在以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的（一般在5分钟左右完成）。 • 阳性反应在膜上呈现红色斑点。

43. 试剂盒组成①渗滤装置，是斑点金免疫渗滤试验试剂盒中主要组成成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成；②胶体金标记物 ；③洗涤液 。 • 操作要点 ①将渗滤装置（或称反应板）平放于实验台面上，于小孔内滴加待测标本1~2滴，待完全渗入；②于小孔内滴加免疫金试剂1~2滴，待完全渗入；③于小孔内滴加洗涤液2~3滴，待完全渗入；④在膜中央显示清晰的淡红色或红色斑点者判为阳性反应，反之则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性程度。

44. 13. 抗ENA抗体谱的检测与应用 抗ENA抗体谱:可提取核抗原抗体的总称 临床常检测的抗ENA抗体谱主要包括： 抗Sm 抗U1-RNP 抗SSA 抗SSB 抗Jo-1 抗Scl-70 抗rib-P蛋白

45. 免疫印迹法 免疫印迹法 SDS-PAGE电泳 转移电泳 酶免疫检测

47. （1）抗Sm抗体： • 是SLE的特异性抗体。 Sm抗原是U族小分子细胞核核糖核蛋白（UsnRNP），具有抗原性的蛋白的分子量是29KD、28KD、13.5KD。 • 对早期、不典型的SLE或经治疗缓解后的回顾性诊断有一定意义。 • Sm抗体和SnRNP是同一分子复合物中的不同抗原位点，抗Sm抗体阳性均伴有抗U1RNP抗体，而抗U1RNP抗体可以单独存在。

48. （2）抗SSA／Ro抗体： • SSA／Ro是小分子细胞浆核糖核蛋白（scRNPs），是蛋白和小分子核糖核酸形成的复合物。抗原是含有Y－YRNA的蛋白质，它更多的存在于胞浆中，其分子量有52KD及60KD。52KD的多肽条带与干燥综合征（SS）相关，而60KD的多肽条带则更多存在于SLE患者中。 • 抗SSA抗体主要见于原发性干燥综合征，阳性率高达60％～75％。 • SSA抗体与广泛光过敏性皮炎症状相关。

49. （3）抗SSB/La/Ha抗体： • 是抗小分子细胞核核糖核蛋白（snRNP）。抗原是RNA多聚酶转录中的小RNA磷酸蛋白质。其分子量为 48KD、47KD、45KD，其中48KD更具特异性。对干燥综合征的诊断具有特异性。 • 抗SSB阳性几乎总伴有抗SSA抗体阳性，抗SSB抗体较抗SSA抗体诊断干燥综合征更特异，是干燥综合征血清特异性抗体。原发性干燥综合征阳性率达40％左右。 • 其他自身免疫性疾病中如有抗SSB抗体，常伴有继发性干燥综合征。唾液腺、唇腺活检可见大量淋巴细胞浸润。

50. （4）抗Scl-70抗体： • 是分子量为100KD的DNA拓朴异构酶I的降解产物，首先在皮肤弥漫型多发性系统性硬化症（PSS）患者血清中发现抗Scl-70抗体。因其主要见于硬皮病，且相应抗原分子量为70KD，故取名为抗Scl-70抗体。 • PSS病人阳性率达30%～40%。虽然阳性率不高，但对PSS（SSC）有较高特异性（特异性达100%）。 • 有抗Scl-70抗体阳性表示病性进展较迅速，皮肤病变往往弥散广泛，易发生肺间质纤维化和指骨末端吸收。