1 / 35

Uzorke za izolaciju virusa uzeti u transportnu podlogu i što pre transportovati do laboratorije

Laboratorijska dijagnoza virusnih infekcija. Uzorke za izolaciju virusa uzeti u transportnu podlogu i što pre transportovati do laboratorije Materijali za detekciju virusnih antigena ili genoma ne moraju se uzimati u transportn oj podlo zi.

emmanuel-parsons
Download Presentation

Uzorke za izolaciju virusa uzeti u transportnu podlogu i što pre transportovati do laboratorije

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Laboratorijska dijagnoza virusnih infekcija • Uzorke za izolaciju virusa uzeti u transportnu podlogu i što pre transportovati do laboratorije • Materijali za detekciju virusnih antigena ili genoma ne moraju se uzimati u transportnoj podlozi

  2. Uzorke seruma potrebno je uzeti što ranije u akutnoj fazi bolesti i 2-4 nedelje kasnije, u rekonvalescenciji

  3. Elektronska mikroskopija • Pogodna metoda za dijagnostiku virusa koji se ne mogu kultivisati • Neophodan određen broj virusnih čestica u uzorku • Tehnike: negativni kontrast, difuzija u agaru, pseudoreplike, imunoelektronska mikroskopija, ultratanki rez

  4. Detekcija virusnih antigena • Detektuju se intracelularni (imunofluorescenca, imunoperoksidaza) i ekstracelularni (imunoenzimski, radioimuno tehnike) antigeni

  5. Detekcija virusnog genoma • Tehnike hibridizacije nukleinskih kiselina, umnožavanja gena, elektroforeza u poliakrilamidnom gelu

  6. Izolacija virusa • Za izolaciju se upotebljavaju kulture tkiva, embrionisana jaja i laboratorijske životinje • Tkivne kulture: primarne, diploidne kontinuirane

  7. Primarne ćelijske linije: ćelije u ovim kulturama imaju isti broj hromozoma i iste karakteristike kao i matične ćelije • Diploidne ćelijske linije zadržavaju diploidan broj hromozoma kroz najviše 50 pasaža • Kontinuirane ćelijske linije su promenile hromozomsku strukturu i imaju sposobnost neograničenog razmnožavanja (HeLa, HEP-2, Vero)

  8. Dokazivanje rasta virusa u kulturi ćelija • Citopatogeni efekat (CPE) Intracitoplazmatske vakuole,inkluzije u citoplazmi i/ili jedru, ćelije se zaokružuju, smanjuju, povećavaju, gube sposobnost adherencije, formiraju grozdove

  9. Infectious bovine rhinotracheitis (bovine herpesvirus) CPE

  10. Pseudorabies (swine herpesvirus) CPE in swine kidney cells

  11. Cowpox virus CPE in sheep kidney cells

  12. Dokazivanje rasta virusa u kulturi ćelija • Hemadsorpcija Pojedini virusi ne pokazuju CPE ali menjaju svojim antigenima površinu ćelije tako da ona dobija sposobnost da adsorbuje eritrocite

  13. Dokazivanje rasta virusa u kulturi ćelija • Hemaglutinacija Pojedini virusi imaju osobinu da aglutiniraju eritrocite čoveka ili raznih životinjskih vrsta. Za razliku od hemadsorbcije u ovoj reakciji učestvuju virusi oslobođeni iz ćelija ili njihovi solubilni produkti.

  14. Dokazivanje rasta virusa u kulturi ćelija • Interferencija Pojava da razmnožavanje jednog virusa u kulturi tkiva sprečava razmnožavanje drugog, kasnije dodatog poznatog virulentnog virusa koji pokazuje CPE

  15. Za identifikaciju virusa čije je razmnožavanje dokazano nekom od prethodno opisanih metoda primenjuju se direktna imunofluorescenca, RVK, RIH, imunoperoksidaza, test neutralizacije

  16. Pileći embrion se koristi za primarnu izolaciju virusa, pripremu virusnih antigena i vakcina

  17. Horioalantoična membrana • Amnionska šupljina • Alantoična šupljina • Žumančana kesa

  18. Dokazivanje virusa u pilećem embrionu Direktno dokazivanje na osnovu smrti embriona ili pojave poksova (ograničenih plaža inficiranih ćelija na horioalantoisnoj membrani) • Horioalantoična membrana se koristi za izolaciju poks i herpes virusa kao i za kvantitativno određivanje virusa na osnovu broja poksova.

  19. Pseudorabies virus pocks on chorioallantoic membrane of embryonating chicken egg

  20. Laboratorijske životinje • Miš, zamorac, kunić, majmun • Registruju se nespecifični i specifični simptomi virusnog oboljenja. Ako se ne pojave životinja se žrtvuje i ispituje se prisustvo virusa u tkivima i organima.Histološkom analizom moguće je utvrditi prisustvo inkluzija u inficiranim ćelijama (Negrijeva telašca karakteristična za virus besnila).

  21. Serološka dijagnostika • Dokazivanje virus specifičnih antitela u serumu inficirane osobe • Prati se porast titra antitela u parnom serumu (akutnom i rekovalescentnom),4x

  22. Na osnovu principa reakcija serološke reakcije mogu se podeliti u tri grupe: • Određuje se prisustvo At koja blokiraju biološku aktivnost virusa (test neutralizacije virusa, reakcija inhibicije hemaglutinacije) • At posle reakcije sa virusnim Ag dovode do reakcije nezavisne od virusa (RVK) • Metode koje direktno mere interakciju antigen-antitelo

  23. Testovi iz treće grupe baziraju se na dokazivanju IgM antitela kao markera aktuelne infekcije • Dijagnoza se može postaviti samo iz jednog uzorka • Visoka osetljivost, specifičnost, brzo dobijanje rezultata, istovremeno testiranje većeg broja uzoraka (ELISA), mogućnost automatizacije

  24. Hemagglutination and hemagglutination inhibition

  25. Virus neutralization

  26. Titriranje virusa • Titar virusa: broj virusnih čestica u 1ml virusne suspenzije. Određuje se: • brojanjem plaka u KĆ • brojanjem poksova na horioalantoisnoj membrani • reakcijom hemaglutinacije • titracijom na koži laboratorijske životinje • određivanjem LD50, ID50, KTD50, PD50

  27. Tehnika plaka: na kulturu ćelija inokuliše se virus a posle izvesnog vremena agar na 45oC i neutral crveno (vitalna boja). Virus inficira pojedine ćelije i u njima se razmnožava ali može da inficira samo okolne (zbog agara koji očvrsne), inficirane ćelije ne primaju boju: plakovi (ograničena polja inficiranih ćelija ostaju neobojena).

  28. Pseudorabies virus plaque formation in rabbit kidney cells

  29. Reakcija vezivanja komplementa • Serum + antigeni virusa + komplement • +40C, preko noći • Hemolitički sistem • 370C, 1 h • Ako je komplemnt potrošen (pozitivna reakcija) dolazi do sedimentacije eritrocita • Ako nema antitela u serumu dolazi do hemolize eritrocita

  30. Imunoadherentna hemaglutinacija • Serum + virusni antigeni • 370C • Komplement • 370C • Eritrociti • Pozitivna reakcija je pojava hemaglutinacije

  31. Test neutralizacije • Serum + virus • Inkubacija • Inokulacija mešavine virus-serum u kulturu ćelija • Ako je virus vezao antitelo ne inficira ćelije i nema CPE • Ako u serumu nema antitelavirus inficira ćelije iz kulture, CPE

  32. Reakcija inhibicije hemaglutinacije • Virus + serum • Eritrociti • Ako u serumu postoje antitela ona će se vezati za virus i blokiraće receptore na površini virusa i eritrociti neće aglutinirati • Ako u serumu nema antitela dolazi do aglutinacije eritrocita

More Related