Apoptóza Detekce Význam

1. Apoptóza Detekce Význam

2. Obsah • Definice, historie apoptózy • Morfologie apoptózy • Fáze a mechanizmy vzniku procesu apoptózy • Metody detekce apoptózy • Apoptóza ve fyziologických procesech • Apoptóza v patologických procesech • Apoptóza v diagnóze a terapii a perspektivy výzkumu

3. Definice, historie apoptózy • Programovaná buněčná smrt, aktivní proces, liší se od nekrózy • Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenom with wide ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer (1972), 26, 239 • Evolučně konzervovaný (Caenorrhabditis elegans) • Apoptosis – podzimní padání listů ze stromů

4. Morfologie apoptózy Kondenzace chromatinu Budding Apoptotická tělíska

5. Morfologie apoptózy(ELMI)

6. Fáze a mechanizmy vzniku procesu apoptózy • Indukce apoptózy • Aktivace efektorů apoptózy • Fáze degradace

7. Indukce apoptózy • Radiace • Hypertermie • Cytostatika • Cytokiny • Interakce T lymfocytů s cílovými buňkami • Hypoxie, kyslíkové radikály, atd.

8. Aktivace efektorů apoptózy • Receptorová signální dráha • Nereceptorová signální dráha-poškození DNA, hypoxie, atd. • Mitochondriální signální dráha Pozn. Na všech drahách se podílí členové rofiny BCL-2 !!

9. Apoptóza - receptorová signální dráha(převzato z Science, Vol 281, p 1306, 1998)

10. Apoptóza - receptorová signální dráha (FAS-L)

11. Apoptóza - nereceptorová signální dráha(převzato z Science, Vol 281, p 1320, 1998)

12. Mitochondriální signální dráha • APAF • Cytochrom c • Ionty Ca

13. Rodina proteinů BCL-2 (antiapoptotické)(převzato z Science, Vol 281, p 1322, 1998)

14. Rodina proteinů BCL-2 (proapoptotické)(převzato z Science, Vol 281, p 1322, 1998)

15. Kaspázy (Caspases) • Cysteinyl Aspartate Specific Proteinases • Neaktivní prekurzory • Specifické substráty

16. Fáze degradace • Substráty kaspáz • lamin B • keratin 18 • PARP • Fragmentace DNA - DNA laddering • Změny na cytoplasmatické membráně

17. Fáze a mechanizmy vzniku procesu apoptózy – souhrný graf I.(převzato z xxx)

18. Fáze a mechanizmy vzniku procesu apoptózy – souhrný graf II.(převzato z xxx)

19. Fáze a mechanizmy vzniku procesu apoptózy – souhrný graf III.(převzato z xxx)

20. Fáze a mechanizmy vzniku procesu apoptózy – souhrný graf IV.(převzato z xxx)

21. Metody detekce apoptózy • Světelná mikroskopie • apoptotická tělíska • Elektronová mikroskopie – ultrastruktura • kondenzace chromatinu • budding • Změny DNA • DNA laddering, • značení štěpených konců DNA (TUNEL, ISNTA) • Změny na cytoplasmatické membráně – • exposice PS (fosfatidylserin) a vazba Annexinu V • permeabilita membrány a vazba barviv na DNA (Hoechst, DAPI)

22. Metody detekce apoptózy • Substráty kaspáz • detekce štěpení PARP, laminu B, transglutaminázy • Mitochondriální funkce • uvolňování cytochromu c, • změny membránového potenciálu mitochondriální membrány (rhodamin 123, Mitotracker)

23. Metody detekce apoptózy

24. Metody detekce apoptózy

25. Metody detekce apoptózy(TUNEL)

26. Metody detekce apoptózy

27. Metody detekce apoptózy

28. Metody detekce apoptózy(Lamin B)

29. Metody detekce apoptózy

30. Metody detekce apoptózy(xxx)

31. Metody detekce apoptózy • Použití pouze jedné z metod nedokazuje jednoznačně přítomnost apoptózy – je třeba použít nejméně dvě metody (např. morfologie a TUNEL)!!

32. Apoptóza ve fyziologických procesech • Embryogeneze • Klimakterium, senium • Ochrana „imunoprivilegovaných“ míst

33. Apoptóza v patologických procesech • Patologická inhibice apoptózy • Patologická indukce apoptózy

34. Patologická inhibice apoptózy • Nádory • folikulární lymfomy • karcinomy s mutací genu p53 • hormonálně dependentní nádory (karcinomy mléčné žlázy, prostaty, vaječníku) • Autoimunní choroby • systémový lupus erythematodes • glomerulonefritidy

35. Patologická inhibice apoptózy • Virové infekce • Herpesviry • Poxviry • Bakteriální infekce • TBC • Alergická onemocnění

36. Patologická indukce apoptózy • AIDS • Neurodegenerativní onemocnění • Alzheimerova choroba • Parkinsonova choroba • amyotrofická laterální skleróza

37. Patologická indukce apoptózy • Myelodysplastické syndromy • aplastická anemie • Ischemické poškození • infarkt myokardu • mozková apoplexie • Toxické poškození jater • alkohol

38. Apoptóza v diagnóze a terapii a perspektivy výzkumu • Intenzivní studium mitochondriální dráhy • Zaměření na roli iontu Ca v procesu apoptózy • Zlepšení metod detekce apoptózy • fluorescenční dynamická detekce změn na membránách • „timing“ jednotlivých změn – nutnost kvalitní zobrazovaní a záznamové techniky

39. Apoptóza v diagnóze a terapii a perspektivy výzkumu • Imunohistochemické stanovení exprese BCL-2 v dif. dg. folikulární lymfom x folikulární hyperplasie • Imunohistochemické stanovení proteinů regulujících apoptózu jako indikátorů prognózy (BCL-2 u karcinomu mléčné žlázy, stanovení laminu B u astrocytomů...)

40. Apoptóza v diagnóze a terapii a perspektivy výzkumu • Možné ovlivnění regulačních apoptotických drah pomocí genové terapie (v současnosti klinické studie s p53 např. u ca. plic…) • Komplexní analýza apoptotických regulačních drah u různých nádorů pomocí „apoptotických“ DNA chips (microarrays) a laserové mikrodisekce – nové klinické subjednotky = kvalitnější, cílenější léčba