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Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica

Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica. Matías Möller Lab . Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República. 8 de mayo de 2014. Bibliografía recomendada: Physical Biochemistry , Van Holde , 2006, 2nd Ed. Cap. 15.

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Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica

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Presentation Transcript

  1. Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República 8 de mayo de 2014

  2. Bibliografía recomendada: PhysicalBiochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15. J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122. Introductiontoproteomics, Liebler, 2002. Massspectrometry in structuralbiology and biophysics, 2nd Ed, Kaltashov & Eyles, Cap. 3

  3. Espectrometría de masa 1- Generalidades 2- MALDI-TOF 3- ESI-Q 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS

  4. Espectrometría de masa 1- Generalidades

  5. Espectrometría de masa Técnica que permite la separación y determinación de la relación masa/carga de iones gaseosos

  6. Espectrometría de masa Espectrometría ≠ Espectroscopía (Medición de un rango) (implica absorción o emisión de energía radiante)

  7. Espectrometría de masa Espectrometría de masa de Biomoléculas • Determinación de masa y/o composición: • Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares • Polisacáridos, oligosacáridos • Lípidos  Lipidoma • Fragmentos de ácidos nucleicos Técnica muy sensible: puede analizar mg-ng (y menos) de material

  8. Espectrometría de masa Espectrometría de masa de Proteínas • Determinación de masa y/o composición • Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos • Modificaciones postraduccionales • Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínas Interacción con compuestos de bajo PM • Plegamiento • Niveles de expresión/modificación posttraduccional

  9. Gel 2D de hígado humano http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/

  10. Masa (definiciones) • Se determinam/z • q = ±ze , e = 1.6022 x 10-19 coulomb • zsiemprees un integral positivo

  11. Masa • Todaslas moléculas tienen una composición química única, pero presentan una heterogeneidad “física” debido a la presencia de isótopos (mismo número de protones pero diferente número de neutrones) 6 12 13 14 C C C C 6 6 6 12.011

  12. Carlos Cerveñansky

  13. Masa • La fracción de isótopos “pesados” en elementos abundantes en moléculas biológicas (CHONP) no sobrepasan el 1% • Sin embargo, en moléculas grandes, las contribuciones de los elementos pesados se vuelven importantes

  14. Masa • Ejemplo: 12C (98.9%) y 13C (1.1%) En Buckminsterfullereno (C60) La probabilidad que todos los átomos sean 12C: P = (0.989)60 = 0.515

  15. Masa

  16. Masa

  17. Masa: definiciones • Masa molecular se mide en unidades de masa atómica unificadas (u) • u = m(12C) /12 = 1.6605402 × 10-27 kg (u es equivalente a 1 g/mol, y a Da, también se usaba a.m.u., considerado ahora -2009- arcaico) • Peso atómico: promedio por composición isotópica → Peso molecular • Masa nominal: masa calculada con los isótopos más livianos, redondeado al entero • Masa más abundante • Masa promedio

  18. Masa: definiciones Carlos Cerveñansky

  19. Masa: definiciones

  20. Determinación del número de cargas (z) 100 95 90 524.3 85 80 75 70 65 60 55 Relative Abundance 50 45 40 35 30 525.3 25 20 15 10 526.2 5 0 520 521 522 523 524 525 526 527 528 529 Una sola carga: Delta = 1.0 amu Delta = 1.0 amu Delta = 1.0 amu m/z

  21. Determinación del número de cargas (z) 100 95 262.6 90 85 80 75 70 65 60 55 Relative Abundance 50 45 40 35 30 25 263.1 20 15 10 263.6 5 0 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 Dos cargas: Delta = 0.5 amu Delta= 0.5 amu Delta = 0.5 amu m/z

  22. Espectrometría de masa de proteínas 37 kDa 37136 amu

  23. Espectrometría de masa Los Iones son importantes En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones  cambios en m/z: [M+H]+o[M-H]- De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos, fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+) [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]- De la unión de iones especialmente a moléculas que contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da) [M]*+, [M]*- (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)

  24. Espectrometría de masa M(péptido) = 1162 Da Modo positivo Modo negativo m = +1 +23 +39 -1

  25. Espectrometría de masa Espectrómetro de masa Muestra Entrada: Volatilización/ Ionización Analizador de masas Detector TOF Cuadrupolo Tampa de Iones FTICR Orbitrap Sector Magnético MALDI ESI Alto Vacío

  26. Espectrometría de masa ¿Cómo volatilizar una proteína? Premio Nobel de Química 2002 Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization Sin Premio: Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: MatrixAssisted LDI (como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)

  27. Espectrometría de masa Espectrómetros de masa (configuraciones para grandes biomoléculas) MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization- Time of Flight ESI-Q:ElectroSprayIonization-Quadrupole ESI-IT:ElectroSprayIonization-Ion Trap FT-MS: ESI-Fourier-TransformIon CyclotronResonance Orbitrap: ESI-orbitrap

  28. Espectrometría de masa 2- MALDI-TOF

  29. Espectrometría de masa Ionización por MALDI: (Matrixassisted Laser desorption/ionization) (Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz) Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra:

  30. Espectrometría de masa Ionización por MALDI: La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador. El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+. Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico

  31. Espectrometría de masa MALDI-TOF Matriz: acidosaromaticos

  32. Espectrometría de masa 4HCCA DHBA SA

  33. Espectrometría de masa MALDI-TOF Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo a su “tiempo de vuelo”(t). t  (m/z)1/2 las partículas con menor m/z llegan antes al detector No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)

  34. Espectrometría de masa MALDI-TOF Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una energía cinética: Ek = zeEs donde s es la distancia de la región de la fuente. E + - + + D s Detector Fuente

  35. Espectrometría de masa MALDI-TOF Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. Ek = zeEs= ½mv2 v = (2zeEs/m)½ E + - Sin E, iones a la deriva Fig. Separación por TOF + + + + D s Detector Fuente

  36. Espectrometría de masa MALDI-TOF Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. Los iones con igual carga tienen la misma Ek, v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2

  37. Espectrometría de masa MALDI-TOF E + - Sin E, iones a la deriva Fig. Separación por TOF + + + + D s Detector Fuente ½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2

  38. Espectrometría de masa Tubo de vuelo 4-25 kV Detector Carlos Cerveñansky

  39. Espectrometría de masa Tubo de vuelo 4-25 kV Detector Los iones con mayor m/z se mueven más lento, mayor t Carlos Cerveñansky

  40. Espectrometría de masa MALDI-TOF Generalmente se observa la especiemonocargada (M+H)+

  41. Espectrometría de masa MALDI-TOF Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF Se puedendistinguirproteinas en unamezclaporsu MM

  42. Espectrometría de masa MALDI-TOF Se puedenestudiarmasas en un ampliorango

  43. 1672.92 Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) Resolución en MALDI-TOF Carlos Cerveñansky

  44. Espectrometría de masa 3- ESI-MS

  45. Espectrometría de masa ESI ElectroSprayIonization Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2 (gas secante). El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray) N2

  46. Espectrometría de masa ESI ElectroSprayIonization Por acción del gas secante y del vacío, el solvente se va evaporando y generando gotas más pequeñas muy cargadas que estallan para formar gotas aún más pequeñas hasta que quedan sólo proteínas cargadas que son dirigidas hacia el analizador N2

  47. Espectrometría de masa ESI-Q Al analizador de masas de Cuadrupolo(Q) se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados. Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas

  48. Espectrometría de masa ESI-Q Variando las señales eléctricas del cuadrupoloes posible variar la m/z que tiene trayectoria estable y realizar un barrido espectral Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, pero no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000

  49. Espectrometría de masa Trampa de iones Analizador de masas muy utilizado con ESI, atrapa los iones mediante voltajes oscilantes en los electrodos, enfocando los iones en el centro de una “caja”.

  50. Espectrometría de masa ESI-MS La ionización de proteínas por ESI generar iones con diferente número de cargas, por adición de diferente número de protones m/z = (M+n)/n Donde n es el número de protones (masa = 1.0078 u, ~ 1)

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