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Mammalian expression vector speaker : Yen-chin Liu 劉 燕 琹

Mammalian expression vector speaker : Yen-chin Liu 劉 燕 琹. Mammalian expression vector ( 哺乳類動物細胞表現載體 ). 定義： 當 DNA 接入此種載體，經送入哺乳類動物細胞內， 而使此段 DNA 序列能夠表現出蛋白質. 條件： 含有複製起始點 Ori → 能在寄主細胞內自行複製 有限制酶 ( restriction enzyme ) 切點 → 用於 DNA 切接

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Mammalian expression vector speaker : Yen-chin Liu 劉 燕 琹

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Presentation Transcript

  1. Mammalian expression vector speaker :Yen-chin Liu 劉 燕 琹

  2. Mammalian expression vector (哺乳類動物細胞表現載體) 定義：當DNA接入此種載體，經送入哺乳類動物細胞內， 而使此段DNA序列能夠表現出蛋白質 條件： 含有複製起始點Ori → 能在寄主細胞內自行複製 有限制酶(restriction enzyme)切點 → 用於DNA切接 含有耐抗生素基因 → 以利篩選 安全無毒性 → 對寄主細胞無害

  3. 含有起動子(promoter) →為RNA polymerase結合的地方， 是DNA轉錄為RNA之起始部位 含有核醣體結合區(ribosome binding site, RBS) → mRNA 與ribosome結合後，由mRNA的5´→3´端逐一合成蛋白質 含有轉譯起始部位ATG；終止部位TAA、TAGor TGA 含有多重選殖位(multiple cloning sites, MCS) → 插入欲表 現基因 gene promoter RBS ATG MCS TAA expression vector

  4. 在哺乳動物細胞上發展轉殖的目的： 為了knockout基因表現，將細胞內某一基因失去作用， 以瞭解某一基因在細胞內的功能 利用動物生產重要蛋白質，伴隨乳汁分泌出來，通常是 醫藥上的蛋白質 基因治療(gene therapy)，將健康的基因取代患者的遺 傳致病基因，使其遺傳病消失

  5. 依據外源基因( exogenous gene)進入哺乳動物細胞的方式 分類： (一) Calcium phosphate-mediated transfection DNA 溶液( plasmid DNA )與0.125 M CaCl2 及1.5 mM Na2HPO4 混合形成 CaPO4 / DNA 沈澱，用以感染哺乳動物細胞

  6. (二) DEAE dextran-mediated transfection DNA 溶於分子量為500 kD 的diethylaminoethyl dextran 培養液 中，DNA負電荷與 DEAE-dextran 結合被細胞吞入，因此容易 送入寄主細胞內 (三) Electroporation 將plasmid DNA 混合於細胞懸浮液並置於一容器中，容器接 上(+)及(-)電以2 ~ 4 kV電壓在4℃溫度之下通電10 min，約有 60 ~ 90 % 細胞經此通電處理可以存活，高電壓通電可以使 細胞膜有孔洞，因而DNA進入細胞內

  7. (四) Liposome-mediated transfection 磷脂質溶於有機溶劑中經揮發形成一薄層，加入DNA溶液 並經超音波震盪可做成各種大小的脂球體( liposome )，內部 是DNA溶液而其外是磷脂雙層膜，此 liposome 攜帶DNA能經 由與細胞膜的融合，而將DNA送入哺乳動物細胞內 Liposome

  8. 以上方法均是以化學及物理方式，將帶有轉殖基因的 載體轉染哺乳動物細胞 優點： 能控制毒性 ( controlled toxicity ) DNA大小沒有限制 ( unlimited DNA size ) 缺點： 獲得穩定的轉染細胞則需幾週至幾個月的時間 插入寄主染色體機率低 ( very low integration ) 基因傳遞效率低 ( very low transfected efficient )

  9. (五) Viral vector-mediated transfection 利用virus可以感染哺乳動物細胞且快速的特性，將病毒 DNA適當的剪接去除有害的片段，將外來DNA接入病毒 DNA內，經感染而送入細胞內 capsid http://www.nettally.com/prusty/gene.htm

  10. Viral vector 猿猴病毒40 ( simian virus, SV40 ) 腺病毒( adenovirus ) 牛乳狀突病毒( bovine papilloma virus, BPV ) 反轉錄病毒(retrovirus)

  11. 猿猴病毒40 ( simian virus, SV40 ) • 又名猿猴空泡病毒40 ( simian vacuolating virus40) • 源自恆河猴腎臟細胞內，但不影響本身細胞病變 • 直徑45 nm、20面體立體對稱 • 含5243個鹼基對組成的環狀雙股DNA • 為多瘤病毒( polyoma virus )，可誘發 多個部位或器官產生肉瘤或癌症 • 感染對象為倉鼠、大鼠、猴、人類等 • 第一個選殖病毒載體用於感染哺乳類動物

  12. SV40病毒基因體( SV40 genome ) 分為早基因及晚基因區域 早基因在病毒感染寄主早期便能表現，早基因產物為大T抗原( large T antigen )是促使病毒DNA在容許性細胞(permissive cell)中複製的因子。 晚基因僅於病毒的DNA開始複製後才表現。晚基因會製造病毒的被囊體( capsid )蛋白質，或稱病毒的外殼。

  13. SV40病毒選殖載體實例 以HindIII與BamHI切割載體，插入兔子球蛋白基因 (β-globin gene)。原本在HindIII與BamHI切位間之片段因此被移除，換上兔子之基因，此viral vector稱為SVGT-5。 重組的SV40病毒顆粒再去 感染猿猴腎細胞，使兔子 的β-globin得到高效表現。 HindIII BamHI Late genes SVGT-5 Early genes

  14. 腺病毒 ( adenovirus, Ad ) • 大小為36 kb的線型雙股DNA病毒 • 直徑約80 nm、20面體立體對稱 • 可插入較大的外源DNA片段，還 可以在寄主细胞中大量表現 • 能感染不分裂或具分裂能力的細胞 • 可以感染不同種類的細胞 • 感染對象為倉鼠、大鼠、人類等 • serotype有Ad5及Ad2，安全性高，少致癌性 http://www.medgadget.com/archives/img http://www.brackeler.com/products/fid/2862

  15. adenvirusgenome • adenovirus transfect host cell ITR 3´ 5´ ITR ATCG‧‧‧ ‧‧‧GCTA ← E1 →← E2 →← E3→ ← E4 → protein 5.5 kD 約100bp的ITR ( inverted terminal repeats)

  16. adenovirus病毒選殖載體實例 Recombinant Human Adenovirus Type 5 Injection • 商品名：安柯瑞 • 在刪除了E1B和E3區基因片段之後，能夠特異性地在腫瘤 細胞中複製、包裝及釋放，最終導致癌細胞裂解 • 在正常組織細胞中不能有效複製，因而無損傷作用 • 透過免疫系統，殺滅 癌細胞 • 用於治療鼻咽癌 http://big5.cancerotc.com.cn/news/20070522145625125.htm

  17. 牛乳狀突病毒 ( bovine papilloma virus, BPV ) • 大小為7.9kb的雙股環狀DNA病毒 • 直徑約55 nm、20面體立體對稱 • 造成牛的皮膚病，卻可在老鼠細胞內形成多個病毒，而不殺死老鼠細胞 • 帶有exogenous gene的BVP DNA，可獨立存在，不與老鼠細胞的染色體合併 • 可插入較大的外源DNA片段，且載體基因不大，容易操作 • 感染對象為小鼠

  18. BVP病毒基因體( BVP genome ) • 分為早基因( E 區)及晚基因( L 區)區域。早基因，即長度為5.5kb的BamHI-Hind III片段，佔基因组總長的69%，故叫做BPV-69T • BPV病毒DNA上如果插有pBR322質體的序列，則能往返大腸菌及老鼠細胞間，作為能夠傳遞外來基因於這兩種生物細胞的載體，也稱往返載體( shuttle vector ) Late genes Late genes BVP-pBR322 Early genes Early genes http://sky.scnu.edu.cn/life/class/genetics/gene%20engineering/chaper8/5.htm

  19. BVP病毒選殖載體實例 若HindIII與BamHI切割載體，插入人β-globin gene到BVP-pBR322重組結構上。形成既能在E. coli及mammalian cell中複製的穿梭載體BVP-BV1。 • 刺激轉化效率提高約500倍 • 在每個細胞中的copy number可 保持在10~30份之間 • 轉化到E. coli後，可迅速回收 載體DNA Human βglobin gene BVP-BV1

  20. 反轉錄病毒 ( retrovirus ) • 線型正性單股RNA( + ssRNA )病毒 • 內含兩條8~11kb的+ ssRNA構成 • 直徑約25 nm、20面體立體對稱 • 可反轉錄為(-)DNA，再產生雙股DNA • dsDNA會插入整合( integrated )到寄主細胞的染色體中 • 鳥類的脾壞死病毒( SNV ) 人類免疫缺失病毒( HIV ) 莫洛尼氏小鼠白血病病毒 ( Moloney murine leukemia virus, Mo-MLV )

  21. retrovirus structure • ( a )反轉錄酶、pol基因產物 • ( b ) 2個RNA分子 • ( c )脂質雙層膜 • ( d )病毒外殼蛋白質 ( gag基因產物 ) • ( e )病毒外膜醣蛋白 ( env基因產物 ) ( a ) ( b ) ( c ) ( d ) ( e ) lhttp://sky.scnu.edu.cn/life/class/genetics/gene%20engineering/pictures/chap%208/8-19.jpg

  22. retrovirus transfection ( + ) ( — ) ( — ) ( + ) http://www.supermt.com.tw/edu/about%20biotech/viruse.pdf

  23. retrovirus病毒基因體( retrovirus genome ) • 5´端有Cap； 3´端有poly (A) • gene order：5´- gag – pol – env -3´ • R region：a short ( 18-250nt ) is terminally redundant • U5：a unique, non-coding region of 75-250nt • Primer Binding Site：used to begin reverse transcription • Leader：a relatively long ( 90-500nt ) non-translated region • Polypurine Tract：responsible for initiating • U3：a unique non-coding region 5´ 3´

  24. retrovirus病毒選殖載體實例 A.輔助型反轉病毒RNA B.反轉病毒RNA表現載體 標的細胞 病毒RNA分子 ( + ) 包裝細胞株 細胞受器 反轉錄反應 ( + ) 病毒DNA分子 標的外源基因組表達產物 釋放包裏外源基因的病毒包裝載體 http://adm.ncyu.edu.tw/~apmicro/academic/2005%20microbial%205.pdf

  25. Vectors used in gene therapy clinical trials

  26. 常見病毒基因轉殖載體的優、缺點

  27. Thanks for your attention

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