Métodos de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (TSA)

1. Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado Diretora Técnica Instituto Paulista de Doenças Infecciosas e Parasitárias Laboratórios Laboratório Central - HSP - UNIFESP Métodos de Teste de Sensibilidade aosAntimicrobianos (TSA)

2. sair

3. Beta Lactâmicos sair • GRUPOS: • Penicilina • Cefalosporinas • Monobactâmicos: aztreonam • Carbapenêmicos: imipenem meropenem ertapenem Anel -lactâmico O Sítio de ação da -lactamase

4. Cefalosporinas sair 3a Geração 1a Geração Cefazolin Cefoperazona Cefotaxima Ceftazidima Ceftizoxima Ceftriaxona 2a Geração Cefamandol Cefonicid Cefotetan Cefoxitina Cefuroxima 4a Geração Cefepima

5. RESISTÊNCIA BACTERIANA AOS ANTIMICROBIANOS sair Aeróbios Metronidazol Natural ou intrínseca ou Constitutiva Anaeróbios Aminoglicosídeos Mutação de genes Adquirida Cromossômica Resistência única-não é transmitida de célula para célula a menos que o gene esteja em integron Produção: ß-lactamases, fosfotransferases, hidrolases, redutases. Plasmidial Transmissível Resistência múltipla

6. sair Evolução Clínica Paciente Imunidade Farmacologia Antimicrobiano Microrganismo Teste de sensibilidade

7. sair Reprodução da placa de Fleming para a prova de sensibilidade aos antibióticos Reprodução da descoberta de Fleming

8. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS sair • METODOLOGIAS • Avaliação QUALITATIVA • DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR • Avaliação QUANTITATIVA • DILUIÇÃO EM CALDO • Macrodiluição • Microdiluição • DILUIÇÃO EM ÁGAR • AUTOMATIZADOS • ETEST

9. MACRODILUIÇÃO sair Método quantitativo  MIC g/mL 100 50 25 12.5 6.25 3.12 .16 .8 .4 controle • Conceito • Precisão • Vantagens • Desvantagens

10. MACRODILUIÇÃO EM CALDO sair

11. Determinação do MIC sair MIC É a menor concentração inibitória mínima que inibe completamente o crescimento bacteriano. g/mL 12.5 6.25 3.12

12. MACRODILUIÇÃO sair MIC g/mL 100 50 25 12.5 6.25 3.12 .16 . 8 .4 controle • • • • • • • • • • • • • • • • • • • MBC

13. MICRODILUIÇÃO sair

14. TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR sair • Utilizado rotineiramente • Fácil execução • Flexibilidade na escolha dos antibióticos • Reprodutibilidade nos resultados • Padronização dos resultados • Baixo custo

15. TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR sair Princípio do método

16. Teste de sensibilidade aosantimicrobianos sair Leitura e Interpretação mm

17. DILUIÇÃO EM ÁGAR sair • Utilizado em estudos epidemiológicos • Fácil execução • Permite testar vários isolados simultaneamente • Promove resultados quantitativos • Permite o teste de bactérias fastidiosas • Baixo custo (relativo) Poucos isolados • Preparo das placas e estocagem

18. DILUIÇÃO EM ÁGAR sair Ágar com 6 g/mL de Vancomicina Enterococcus spp. S   4 g/mL I  8-16 g/mL R   32 g/mL

19. Diluição em Ágar - Desvantagens sair • Muito trabalhoso, tanto a preparação das placas quanto a preparação do inóculo, especialmente quando vários antimicrobianos devem ser testados • As placas de ágar não podem ser armazenadas por muito tempo Helio Sader - LEMC

20. Etest sair Princípio do método

21. Etest®Difusão sair

22. Teste de sensibilidadeaos antimicrobianos sair Curva de regressão

23. Relação entre o MIC, Zona de inibição e “Breakpoints”. sair

24. MIC  DIFUSÃO sair 100 50 25 12.5 6.25 3.12 .16 . 8 .4 controle g/mL 30 50 25 12.5 6.25 3.12 18 mm

25. Interpretação do Etest sair

26. Interpretação do Etest sair

27. Interpretação do Etest sair

28. NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS CLSI - antigo“NCCLS” sair Organização internacional, interdisciplinar e educacional que promove o desenvolvimento e a ampla utilização de normas e procedimentos laboratoriais padronizados. A subcomissão do CLSI é composta de representantes de profissões, do governo e indústria, incluindo laboratórios de microbiologia, educadores, farmacêuticos, etc.

29. TESTE DE SENSISIBILIDADE AOSANTIBIÓTICOS sair Padronização • Processos Padronizados (POPs) • Controle de qualidade dos itens: • meios (efeito timidina ou timina) • pH • temperatura • incubação • discos (ATCCs) • fitas de Etest

30. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Bactéria e Preparo do Inóculo • Suspensão direta • Método de crescimento 0,5 McFarland 1a 2x108 UFC/mL

31. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Bactéria e Inóculo Bactéria recentemente isolada Colônias bem isoladas

32. CRESCIMENTO BACTERIANO sair

33. TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR sair MEIOS 1- Ágar Mueller-Hinton 2- Ágar Mueller-Hinton suplementado 3- Ágar GC 3- Haemophilus Test Medium (HTM)

34. TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR sair MEIO MUELLER- HINTON • Reprodutibilidade do teste. • Baixo teor de inibidores de sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclinas. • Permite crescimento satisfatório da maioria dos patógenos. • Grande número de dados e experiência com o meio.

35. TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR sair O que devemos saber sobre os meios? • Hidratar e autoclavar • 60 a 70 mL 150 mm 25 a 30 mL 90 mm • pH 7.2 a 7.4 • Conservação 2 a 8oC • Teste de esterilidade 4 mm

36. TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR sair O que devemos saber sobre os meios? • Umidade • Efeito da Timidina ou Timina Inibidores das sulfonamidas e trimetoprim. • Conservação 2 a 8oC • Teste de esterilidade • Efeitos da variação de Magnésio e Cálcio

37. TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR sair Discos • Conservação 8oC ou  freezer (não “frost free”) Imipenem, Ertapenem Cefaclor e combinações de ác.clavulânico • Retirar do refrigerador ou do freezer até 2 horas antes do uso • Evitar umidade • Data de validade

38. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos sair Seleção dos antibióticos • Laboratório Clínico • Infectologistas • Comissão de Infecção Hospitalar • Comissão de Controle de Antimicrobianos • Farmácia

39. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos sair Quando e porquê realizar o antibiograma? • Isolado requer terapia antimicrobiana • Isolado cuja susceptibilidade não é preditiva • Isolado capaz de exibir resistência • Orientação terapêutica • Permite individualizar padrões de resistência

40. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Inóculo Métodos: • Crescimento • Suspensão direta

41. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Inóculo - Método do crescimento • 3 a 5 colônias 4 a 5 mL de TSB • Incubar a 35oC - (2 a 6h) • Ajustar a turbidez 0,5 McFarland 1a 2x108 UFC/mL

42. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Inóculo - Suspensão direta • 3 a 5 colônias 4 a 5 mL de TSB ou salina • Ajustar a turbidez 0,5 McFarland 1 a 2 x 108 UFC/mL • Estabilizar 15 min.

43. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Inóculo

44. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Inoculação

45. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento Inoculação • Superfície do ágar não deve estar úmida • Inoculação homogênea • Esperar diminuir a umidade antes da aplicação dos discos

46. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Aplicação dos discos • Bateria pré determinada • Aplicar e pressionar o disco • Aplicar no máximo 12 discos na placa de 150mm 5 discos na placa de 90mm • Inverter a placa e incubar 15 minutos após a aplicação

47. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Procedimento sair Incubação • Temperatura 35oC • Atmosfera atm ambiente exceção Haemoplilus spp., N. gonorrhoeae e estreptococos CO2

48. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos sair Leitura e Interpretação

49. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS O que testar? Como interpretar?

50. “CLSI-2005 ” sair A lista de cada microrganismo compreende agentes de eficácia comprovada e que tem um comportamento aceitável nas provas in vitro. Quais são os antibióticos devemos utilizar? Grupo A:1ª escolha -testados e reportados Grupo B:1ª escolha - testados e reportados seletivamente Grupo C: suplementares e reportados seletivamente Grupo U:testados em isolados de urina Grupo O:outros não rotineiramente utilizados Grupo inv:em investigação