人禽流感的实验室检测
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人禽流感的实验室检测. 广州市第八人民医院检验科 卢业成 副主任技师. 图一 禽流感病毒图解. 禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。 目前为止,已证实能感染人的禽流感病毒亚型有 H5N1 、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3 等。 对有机溶剂敏感;常用消毒剂易将其灭活。对热敏感,对低温抵抗力强。紫外线直接照射可迅速破坏其活性。. 禽流感病毒对禽致病性强弱划分的依据. 禽流感病毒根据对禽致病性不同,可分为高、中、低三种,其划分依据: 在无类胰蛋白酶条件下,形成融斑的能力; 病毒颗粒 HA 蛋白分子上连接肽碱性氨基酸的多寡; 静脉致病指数:

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人禽流感的实验室检测

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人禽流感的实验室检测

广州市第八人民医院检验科

卢业成 副主任技师


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图一 禽流感病毒图解

  • 禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。

  • 目前为止,已证实能感染人的禽流感病毒亚型有H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3等。

  • 对有机溶剂敏感;常用消毒剂易将其灭活。对热敏感,对低温抵抗力强。紫外线直接照射可迅速破坏其活性。


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禽流感病毒对禽致病性强弱划分的依据

禽流感病毒根据对禽致病性不同,可分为高、中、低三种,其划分依据:

  • 在无类胰蛋白酶条件下,形成融斑的能力;

  • 病毒颗粒HA蛋白分子上连接肽碱性氨基酸的多寡;

  • 静脉致病指数:

    2.0~3.0(波动1.74~3.0) 为高致病性

    1.2~1.4 为中致病性

    0(波动0~1.0) 为低/非致病性


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为何高致病性H5N1亚型禽流感病毒至今仍不具有人传人能力?

一般认为高致病性H5N1亚型禽流感病毒至今仍不具有人传人能力的原因为:

  • 它们的基因组中不含有人流感病毒基因节段;

  • 它们的受体特异性,不同于人流感病毒;

  • 它们的HA蛋白分子上连接肽含多个碱性氨基酸。


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一、实验室检测目的

1、提供确诊病例的实验依据(病原学/血清学)。

2、及时分离出人禽流感病毒并了解其亚型。

3、及时了解病毒株基因组及抗原特性,为疫情预测和 预防提供科学依据,建立我国人禽流感病毒基因库。

A、是否含有人流感病毒基因节段。

B、受体特异性。

C、HA蛋白分子上连接肽碱性氨基酸的多寡。

4、了解所分离毒株的来源。

5、为诊断试剂制备和疫苗生产提供毒株,同时也为抗 体测定提供合适的抗原。

6、通过耐药试验,为治疗药物使用提供科学依据。


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二、实验室生物安全

按照《禽流感实验室检测技术方案》及《传染性非典性肺炎实验室生物安全操作规范》的要求:

  • 凡操作活病毒的试验(如微量中和试验、特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测阳性的采样标本的病毒分离、尸检标本的检测)必须在生物安全III级(BSL-3)的条件下进行。

  • 其余的试验(如特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测)可在生物安全II级+(BSL-2+)的条件下进行。

    按照《禽流感职业暴露人员防护指导原则》的要求:

  • 实验室工作人员应采取相应的生物安全防护,并经过相应的专业技术培训。


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三、标本的采集、包装、运送及保存

1、采集对象

  • 人禽流感疑似病例,临床诊断,确诊病例。

  • 人禽流感疑似病例,临床诊断,确诊病例的密切接触者,一周内出现流感样症状者。

  • 与患禽流感的病、死禽密切接触者,一周内出现流感样症状者。

  • 不明原因肺炎住院患者。

  • 其他根据需要采集的对象。

    2、采集人员

    经过技术培训的医生、护士、CDC工作人员。


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三、标本的采集、包装、运送及保存

3、标本种类及采集时机

  • 上呼吸道标本:包括鼻拭子,鼻咽拭子、鼻咽抽提物、鼻洗液、咽漱液。最佳采集时间为发病后3天内,一般不超过7天。

  • 下呼吸道标本:只采集重症患者,无时间限制。包括气管吸取物、支气管洗液、肺组织活检标本。

  • 尸检标本:病人死亡后应尽早进行解剖。无菌条件下主要采集肺和气管,条件允许下,也可采集肝、肾、脾、心脏、脑、淋巴结等。每种组织应多部位取材,每部位应取20~50g,淋巴结取2个。

  • 血清标本:要空腹采集,采集量为3~5ml。急性期血样应尽早采集,不晚于发病后7天;恢复期血样在发病后2~4周采集(要注意病人是否真正康复和停药)。


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三、标本的采集、包装、运送及保存

4、采集方法

各种标本的采集方法参见《人禽流感样品采集、运输和检测技术规范(试行)》。

5、标本包装

  • 标本必须保存于大小合适、带垫的外螺旋盖的塑料管中,管外写明标本编号、病人姓名及采样日期。

  • 将保存标本的塑料管放入大小适合的塑料袋内密封,每袋只装一个标本。

  • 标本相关的详细信息填写“广东省禽流感疑似病例样本送检登记表”,用塑料袋密封。


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三、标本的采集、包装、运送及保存

6、标本保存

  • 用于病毒分离的标本应尽快进行接种,能在24小时内接种的标本可置于 4℃冰箱暂时保存,不能在24小时内接种的标本应置于 -70 ℃或以下保存。如无 -70 ℃保存条件,则于 -20 ℃冰箱暂存。

  • 血清标本可在 4 ℃冰箱保存 1~3天,-20 ℃或以下可长期保存。标本运送期间应避免反复冻融。

  • 所有标本一式两份,其中一份单独保存,以备复核。


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三、标本的采集、包装、运送及保存

7、标本运输

标本放入专用运输箱内,四周放置冰袋,空隙部分用具有吸水和缓冲性能的材料充填。病毒分离用标本可置液氮运输罐内用于长距离运送,所有运送容器外必须具有生物危险标记。


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四、人禽流感的实验室检测

1、经典检测方法

  • 病毒分离与鉴定:用SPF鸡胚单腔法和MDCK组织细胞分离培养,培养物用HI和NI法进行鉴定。

  • 微量血清中和实验 (参见《广东省流感监测工作规范》)

    2、快速检测方法

  • 核酸检测:RT-PCR或Real Time PCR,建议使用中国流感中心或WHO权威部门推荐的引物和探针。

  • 检测抗原的快速诊断试剂盒:敏感性较低,只能测型特异。

  • 免疫荧光测定:用亚型特异的单抗标记。


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四、人禽流感的实验室检测

3、血清学试验

  • 主要是测定患者血中的禽流感病毒抗体。

  • 采急性期和发病后2~4周恢复期的双份血清同步检测。恢复期血清抗体滴度增高4倍或4倍以上判断为阳性。

  • 常用ELISA、免疫荧光等方法,有专用商品试剂盒供应。

    4、常规检验项目

  • 血常规:

  • 肝肾功能:

  • 心肌酶:

  • 血气分析:


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四、人禽流感的实验室检测

5、检测结果的判断

阳性结果

  • H5、H7、H9基因核酸检测,具备以下任何一条:

    1)两对亚型特异性引物都能扩增出预期大小的产物

    2)一对亚型特异性引物的扩增产物其序列经比对证实

  • 用亚型特异的单抗,免疫荧光测定阳性

  • 病毒分离及鉴定

  • 血清学实验:抗体滴度有4倍或以上升高


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五、人禽流感实验室检测应注意的问题

  • 把握好临床标本的采集时机。

  • 严格按照有关规定开展检测工作,切实做好标本的上送及转运工作。

  • 严格按照有关规定做好实验室生物安全防护,妥善处理废弃标本和实验室产生的医疗垃圾。

  • 严禁实验室交叉污染:在病毒分离时严禁设阳性对照及操作在人群中已消失的流感病毒。

  • 禽流感病毒在 -20℃~-40℃时不稳定,长期保存应在 -70℃以下。


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