1 / 37

KROMATOGRAFİ

KROMATOGRAFİ. Analitik Kimya II. Kromatografi. Analizi yapılmak istenen gerçek numuneler genellikle kompleks karışımlardır ve karışım içerisindeki maddeler birbirlerinin analizlerini etkileyebilirler. Kromatografi karışım halinde bulunan numunelerin analizinde kullanılan bir grup tekniktir:

edawn
Download Presentation

KROMATOGRAFİ

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. KROMATOGRAFİ Analitik Kimya II

  2. Kromatografi • Analizi yapılmak istenen gerçek numuneler genellikle kompleks karışımlardır ve karışım içerisindeki maddeler birbirlerinin analizlerini etkileyebilirler. • Kromatografi karışım halinde bulunan numunelerin analizinde kullanılan bir grup tekniktir: • Sabit ve hareketli faz • 20. yy başları, Tswett • Chroma:renkgraphein: yazma

  3. Moleküller arası etkileşimler - + - + İyonik etkileşim katyon anyon Hidrojen bağı su δ+ δ- δ+ δ- δ+ δ- Dipol-dipol etkileşim δ+ δ- δ+ δ- δ+ δ- δ+ δ- Dağılım etkileşim

  4. POLARİTE • Dipol moment, birimi Debye Su: 1.85 D Benzen: 0 D • Oktanol-su dağılım sabiti Kow = CA, Oktanol / CA, su • Benzer benzeri çözer oktanol su Çözünen oktanolü tercih eder Yüksek Kow değeri Apolar çözünen Çözünen suyu tercih eder Düşük Kow değeri Polar çözünen

  5. Kromatografi çeşitlerinin sınıflandırılması

  6. Kağıt kromatografisi • Çok bulunan, ucuz ve gözenekli • Kağıdınreaktifolmayandestekmateryali, glukozunpolimeriolanselülozdur. • Polarite farkları Uygulama: • Başlangıç çizgisi kurşun kalemle çizilmelidir. • Tanktaki çözücü miktarı başlangıç çizgisinin üstüne gelmemelidir. • Kesinlikle çözücünün en sona kadar gelmesi beklenmemelidir. • Kağıt kuruduğunda ayrılmış bileşenler, renkli tabakalar halinde görülür. • Eğer bileşenler renkli değilse UV ışığıyla veya iyot süblimleşmesini kullanarak görüntülenebilir. • Daha yoğun renk, daha fazla konsantrasyon anlamına gelir

  7. İnce Tabaka Kromatografisi • Sabit faz olarak bir plastik veya cam yüzey üzerine adsorban bir materyal kaplanır. • Adsorban materyal olarak en çok alümina (Al2O3) ve silika (SiO2) kullanılır. • Hidrokarbonlar, alkil halojenürler, eter, aldehit ve ketonlar gibi bileşiklerde alümina (daha polar) kullanılır. • Silikanın ise polaritesi daha düşüktür ve alkol , karboksilik asit ve amin gibi farklı grupları içeren polar bileşenlerin ayırımında kullanılır. • İTK kağıt kromatografisinden daha çok kullanılır. • Kantitatif olarak, • lekeler kazınıp başka bir çözeltide çözündükten sonra analiz edilebilir • lekelerin genişliği ölçülür • Optik dansitometri • İki yönlü İTK

  8. Kolon kromatografisi • Adsorbanlar:Alumina, silika veya kalsine edilmiş diyatome • Adsorban destek materyali cam kolon • Adsorbanın altına gözenekli cam veya pamuk yerleştirilir. • Ayrılan bileşikler renksiz ise bir UV lamba yardımıyla veya renklendirici ajanlar yardımıyla gözlemlenir. Görsel: http://www.wikiwand.com/en/Column_chromatography Erişim Tarihi: 24.02.2019

  9. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) • Otomatikleştirilmiş kolon kromatografisi • Duyarlı, hem kantitatif hem de kalitatif analizlere uygun, uçucu olmayan türlere de uygulanabilir • İlaç ve gıda numunelerine uygulamada birinci tercih • 10-30 cm uzunluğunda 4-10 mm çapında çelik borular içerisinde 2-25 µm çapında tanecikli kolon dolgu materyalleri. • Sabit faz sıvı veya katı tanecikler üzerinde ince bir film tabakası (kaplama veya kimyasal bağlama) • Hareketli faz ile sabit fazdaki sıvı karışmamalıdır. • Sıvı-sıvı kromtografisinde ayrımın temeli partisyon

  10. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) H2O Benzen n-HeptanToluenKlorobenzenMetanol Su Asetonitril 0 D 0 D 0.43 D 1.58 D 1.70 D 1.85 D 3.44 D

  11. YPSK Teorik tabaka eşdeğer yüksekliği (TPEY)

  12. YPSK Dedektör • Zamana karşı dedektör cevabının çizildiği grafiklere kromatogram adı verilir. • Bir kolonun ayrım verimliliği teorik tabaka yüksekliği (H) ve sayısıyla (N) ifade edilir. Kolondaki teorik tabaka yüksekliği ne kadar azsa ve tabaka sayısı ne kadar çoksa ayrım daha iyi olur. H = L / N Burada L kolonun uzunluğudur. kolon numune Hareketli faz A B B A B

  13. YPSK Cihazı Bir YPSK cihazının temel bileşenleri: • Mobil faz şişeleri • Pompa: mobil faz akışını sağlamak için • Enjeksiyon ünitesi: numunlerin sisteme enjeksiyonu için • Kolon: sabit faz olarak • Dedektör: Ayrılan numunelerdeki bileşenlerin tespiti için • Yükseltici: Dedektörden gelen sinyallerin yükseltilmesi için • Kaydedici: Sinyallerin görselleştirilip kaydedilmesi için Görsel: https://laboratoryinfo.com/hplc/ adresinden alınarak düzenlenmiştir. Erişim tarihi: 24.02.2019

  14. Pompa sistemleri • 400 atm basınca kadar basınç • Puls içermeyen basınç • 0.1 – 10 mL/dk aralığında akış hızları • ≤%0,5 tekrarlanabilirlikte akış kontrolü • Korozyona dayanıklı parçalar Pompa tipleri: • Pistonlu pompalar (pistonun ileri geri hareketiyle akış sağlanır) • Sürgülü pompalar (Bir kademeli motordan güç alan vidalı güdüm mekanizması ile kumanda edilen sürgülü şırınga benzeri pompa) • Pnömatik pompalar (Biri büyük diğer küçük, birbirine bağlantılı iki pistonlu pompa tipi. Büyük olan sıkıştırılmış hava ile yönlendirilir ve bu hareket küçük olanı hareketlendirir. Ardından küçük pompa sıvıyı iter. Yüksek basınç sağlayan ucuz pompalar. Yüksek hızlarda problem yaşanabilir.) Puls sonucu oluşan doğrusal olmayan akış Puls içermeyen doğrusal akış profili

  15. Enjeksiyon ünitesi • Manuel enjeksiyon • Otomatik enjeksiyon • 1-100 µL enjeksiyon hacmi (daha farklı hacim aralıkları da mevcuttur.)

  16. YPSK kolonları Genel olarak • 10 – 30 cm boyunda çelik borular • 4 – 10 mm kolon iç çapı • 2 – 25 µm arası tanecik büyüklüğü Farklı kolon tipleri de ihtiyaca göre üretilmektedir. «250 x 4.6 x 5µm» Dolgu materyali: • Film dolgular (küresel, gözeneksiz, çapları 30-40 µm cam veya polimer taneleri üzerine silis, alümina gibi bir kaplama materyali ile ince film kaplama) • Gözenekli dolgular ( çapları 3 -10 µm arasında gözenekli materyaller) • Diyatome toprağı

  17. YPSK kolonları • Ayrılan yüksek miktardaki maddelerin analiz sonunda elde edilerek kullanılacağı preparatif çalışmalarda daha geniş kolonlar kullanılır. • Kolonların dayanabileceği spesifik çözücü koşulları (çözücünün cinsi, pHvs) ve sıcaklık koşulları vardır. • Kolon ömrünü artırmak ve kolonun yabancı kirlilikler tarafından kirletilmesini önlemek için «emniyet kolonu» kullanılır.

  18. YPSK Cihazı - Dedektörler • Dedektörler • yığınözelliği (karşılaştırmayadayalı) dedektörleri;hareketlifazınkırmaindisi, dielektriksabitiveyoğunluğugibianalittarafındandeğiştirilenyığınözelliklerinecevapverendetektörlerdir. • analitözelliğidedektörleri,analitin UV absorbansı, floresansşiddetiveyadifüzyonakımıgibihareketlifazınsahipolmadığıbazıözelliklerinecevapverendedektörlerdir.

  19. Absorbansdedektörleri: • Filtreliabsorbansdedektörleri • Yüksek duyarlılık sağlarlar ancak geniş dalga boyu geçirgenlikleri vardır. • Monokromatörlüultraviyoleabsorbansdedektörleri, • Engüçlüultraviyolespektrofotometrikdedektörlerspektrumuntamamıiçingerekliolanverileriyaklaşıkbirsaniyedetoplayabilecekdiyodserili (DAD) cihazlardır. Bu türdedektörlerilezamandançokbüyükorandatasarrufsağlanır.

  20. Floresansdedektörler: • Işık kaynakları : civa lambası, ksenon lambası veya lazerler • Dalga boyu seçici: filtreler veya monokromatörler • Çokdüşükseviyelerdekimaddemiktarıtayinlerindekullanılabilme • Sadece floresans özellikteki maddelerin analizi (türevlendirme ile bu sorun aşılabilir) Görsel: http://www.chromatographyonline.com/how-does-it-work-part-v-fluorescence-detectors Erişim tarihi:24.02.2019

  21. Kırılmaindisidedektörü: Bu dedektörde çözücü, kolonunyoluüzerindebulunanhücreninbiryarımbölmesindengeçer; elüentisediğerbölmeniniçindengeçer. Bu ikibölme, ikiçözeltininkırmaindisibirbirindenfarklıisegelenışınkırılacakşekildeuygunbiraçıdayerleştirilmişbir cam plakaileikiyeayrılmıştır. Fotoduyarlıdedektörünyüzeyinegelenışındemetininyolundansapması, çıkışsinyalinindeğişmesinesebepolur, budeğişiklikyükseltilerekkaydedildiğindekromatogrameldeedilir. Referans hücresi Bilgisayar – Dedektör cevabının görüntülenmesi Fotodiyotdedektör Işık kaynağı Numune hücresi

  22. Elektrokimyasaldedektörler Günümüzdeçeşitlitiptekielektrokimyasaldedektörleramperometri, polarografi, kulometrivekondüktometriesasınagöreçalışmaktadır. Bu dedektörler; duyarlılık, basitlikveseçicilikgibiçeşitliavantajlarasahiptirler. Buna karşılık; yalnızcaelektrokimyasal olarak aktifbileşiklerindeteksiyonundakullanılabilmeleridezavantajdır. Görsel: https://community.asdlib.org/imageandvideoexchangeforum/2013/08/02/electrochemical-detector-for-hplc-separations/ Erişim tarihi: 24.02.2019

  23. Kütlespektrometrikdedektörler • İyonlaştırma sonrası birkütleanalizörüileanaliz • Çok geniş uygulama alanı • gözlenebilmesınırı 1 – 10 pg’akadardüştüğüraporedilmiştir • Günümüzde LC-MS olarak gösterilensıvıkromatografi-kütlespektrometriyanikütlespektrometrikdedektörlerinkullanıldığısıvıkromatografidüşükyakalamavetayinlimitlerinedeniyleilaçlarınfarmakokinetikdavranışlarınıincelemekamacıylabiyoanalitiklaboratuvarlardabiyolojiksıvılarınanalizindeyaygın olarak kullanılmayabaşlamıştır. Hatta, dahahassasvekesinsonuçlaralabilmekiçin LC-MS/MS yaniardarda 2 kütlespektrometrikdedektörünyeraldığıcihazlarbiyoyararlanımvebiyoeşdeğerlikçalışmalarındasıkçakullanılmayabaşlanmıştır.

  24. Diğer dedektörler • Işıksaçılmadedektörleri: Bu dedektörlerde; kolondangeçenmobilfazküçükpartikülleredönüştürülür, çözücüsüuçurulurvedamlacıklarbirışıksaçılmahücresindebelirlenirler. • Kondüktometrikdedektörler; Bu dedektörlerde; ikielektrotarasındangeçenmobilfazıniletkenliğiölçülür.

  25. Hareketlifaz (mobilfaz) hazneleriveçözücümuamelesistemleri • Cam çözücü şişeleri • Çözünmüş gazların giderilmesi için • Cihaza entegre degazer • Cihaz öncesi ultrasonifikasyon • Çözücü filtreleri degazer Görsel: https://www.schambeck-sfd.com/en/hplc-gpc-products/hplc-gpc-online-degasser.php Erişim tarihi: 24.02.2019

  26. Sistem uygunluk parametreleri Kromatografik ayrımın geçerliliği • Teorik tabak sayısı (N) • Seçicilik faktörü (α) • Ayırma gücü (Rs) • Kapasite faktörü (k) • Kuyruklanma faktörü (T) • Asimetri faktörü (As) Bu parametrelerden en az ikisinin gerekli şartları sağlaması sistem uygunluğunu gösterir.

  27. Teorik tabaka sayısı (N) • Teorik tabaka ayrımın meydana geldiği en küçük tabakadır. • Piklerin keskin ve dar olması, teorik tabaka sayısının çokluğunu dolayısıyla kolonun verimliliğini gösterir. N = 16 []2 tRpikin alıkonma zamanı w pikin taban genişliği İdeal olarak N > 2000 olması beklenir. Teorik tabaka Kolon

  28. Seçicilik faktörü (α) İki pikin birbirinden ayrılma derecesini gösteren ve bağıl alıkonma olarak da bilinen seçicilik faktörü şöyle hesaplanır: α = İdeal olarak α > 1 olması beklenir. Yüksek α değerleri iyi bir ayırım gücüne işaret etse de, ayrımın direk bir göstergesi değildir. Bunun için rezolüsyon parametresi daha yararlıdır. Görsel: Chromacademy, e-learningfortheanalyticalchemistrycommunity, The Theory of HPLCChromatographic Parameters

  29. Kapasite faktörü Kapasite faktörü (k) bir analitin bir kromatografi kolonundaki alıkonma zamanının ölçüsüdür. Kolonda tutunan bir analitin alıkonma zamanının kolonda tutulmayan başka bir maddenin alıkonma zamanına oranıdır: k = Yüksek k değeri Düşük k değeri İdeal olarak 2 < k < 8 olması beklenir. Kapasite faktörü numunedeki bileşenlerin nitel tayinleri için kullanılabilir.

  30. Rezolüsyon (Rs) Rezolüsyon bir kolonun iki analiti ayırabilmesinin kantitatif ölçüsüdür. Bir YPSK metodu geliştirmenin en önemli hedefi en kısa sürede optimum rezolüsyonu elde etmektir. Rs = Rs=1,6 Rs=0,4 Genel çalışmalarda Rs > 1,5 olması beklenir.

  31. Kuyruklanma faktörü (T) ve Asimetri faktörü (As) Bu iki faktör de piklerin simetrisinin göstergeleridir. Kuyruklanma faktöründe pik genişliği (w) pik yüksekliğinin %5’inde ölçülürken, Asimetri faktöründe %10’unda ölçülür. • T = w0,05/ 2c • As = b/a İdeal olarak 0,95 < As < 1,20 ve T < 2 olması beklenir.

  32. Cihaz, pik alanı veya yüksekliğinin tekrar edilebilirliği • Enaz 6 defatekrarlanandeneylerbağılstandartsapmadeğeri • Genelayırımlarda<% 1.5 • Biyolojiksıvılardanyapılançalışmalarda< % 5.0 • Eser maddemiktartayinindeise%5 – 15 arasındaolmalıdır. • Cihaztekrarlanabilirliğiiçinalıkonmazamanlarının % bağılstandartsapmasının% 5’ den küçük veyadahaçoksayıdatekraredilenenjeksiyonlariçin % 1’den küçükolmasıistenir.

  33. Avrupa Farmakopesi tarafından tanımlanan sistem uygunluk parametreleri • Teorik tabak sayısı (N) • Seçicilik faktörü () • Rezolüsyon (Rs) • Kapasite faktörü (k) • Kuyruklanma faktörü (T) • Asimetri faktörü (As) • Pik yüksekliği veya alanın bağıl standart sapması • Cihaz tekrarlanabilirliğidir.

  34. YPSK da kalitatifvekantitatifanaliz Kalitatif analiz • Alıkonma zamanı, tR Kantitatif analiz • Pik yüksekliği • Pik alanı • İç standart • Regresyon analizi • Cihaz cevap faktörü

  35. LC–MS kombinasyonu Bu ikiyönteminkombinasyonuilekarışımoluşturanbileşiklerönceayrılırveböylecedahasafbirşekildekütlespektrumunagiderekdahahassasayrım, tanımavetayingerçekleştirilebilir. Bu kombinasyonla, alıkonmazamanlarıaynıolanbenzermoleküllerkütlespektrumlarıfarklıolduğuiçinayrımyapılıpseçicibiranalizsağlanabilir. Böylecekromatografik olarak ayrılamayanbileşiklerin bile seçicivespesifik olarak analizlerigerçekleştirilebilir. Ama, bunlarısağlayabilmekiçinikiyöntemin LC-MS şeklindebirarayagetirildiğinde her ikiyöntem de tekbaşlarınaçalıştığındagözlenenperformanslarınıgöstermelidirler. Bunun içinaşağıdakilerinyerinegelmesigerekir: a.İkiyöntembirleşirkeninterfaz (arafaz) performansdüşüklüğünenedenolmamalıdır. Çünkü YPSK dan çıkannumunedoğrudankütlespektrometresinealınmaktadır. b. İnterfazdangeçerkenveyakütlespektrometresinegeçerkenanalitkontroledilemeyenherhangibirkimyasalmodifikasyonauğramamalıdır. c. Kütlespektrometresineyükseknumunetransferiolmalıdır. Eğerbu transfer interfazdagerçekleşiyoriseiyonizasyonetkinliğiyüksekolmalıdır. d. Analitinkiilekarışmamasıiçininterfazdagürültüoranımümkünolduğuncadüşükolmalıdır. e. İnterfazgüvenilir, kolaykullanılabilirvetekrarlanabilirolmalıdır. f. İnterfazpekçokkromatografikkoşulauygunolmalıdır. Örneğinakışhızı 20 nL/dk dan 2 mL/dk ya, mobilfaz % 100 organikten % 100 sufazınageçişteve gradient ayrımlarınauygunolmasıgibi. g. İnterfazkütlespektrometresininvakumortamındadeğişimyapmamalıdır. Ayrıcakütlespektroskopisininbütünfonksiyonlarıileçalışmasınaolanaktanımalıdır. h. Akışhızı YPSK yagöredüzenlenmelidir. ı. YPSK dakimobilfaz, numunevemobilfazıoluşturandüzenleyicilerin (asetikasit, formikasit, trikloroasetikasit (TCA), trifloroasetikasit (TFA), trimetilamin, trietilamin, amonyumasetat, heptaflorobütirikasit (HFBA) gibi) uçucuolmasıönemlidirvemümkünolduğukadardüşükorandakullanılmalıvekonsantrasyonları da düşükolmalıdır (10 mM kadar). İnterfaz da mobilfazınuçucuolmamasındanvekalıntıbırakmasındanmeydanagelebilecekkalıntılariyonlaşmayıolumsuzetkileyerekanalizigüçleştirirler. Metal fosfatlar, karbonatlar, mineral asitlerve metal bazlarıkullanılmamamalıdır. Genellikle alkali vetoprak alkali metallerinkullanılmasındansakınılmalıdır. i. Oluşturulankütlespektrumu YPSK ileanalizedilebilecekbileşiklerinbimoleküller de dahilolmaküzere 1000 Da‘akadarmolekülağırlıkbilgilerinikarışıklıkolmadanverebilmelidir. Çünkübumoleküllerkolaylıklaparçalanabilir. j. Eldeedilenkütlespektrumuyapısaltayiniçintekrarlanabilir, güvenilirvekütüphanelerilekıyaslanıparaştırılabilecekbilgilersunabilmelidir.

  36. LC–MS kombinasyonu LC–MS kombinasyonunda 2 temel problem gözdenkaçırılmamalıdır: 1) YPSK dan çıkannumunesıvıfazdadır (bazenyüksekmiktardasu daiçerebilir). Dolayısıylakolondançıkannumunedoğrudankütlespektrometresineverilemez. İnterfazıngörevibumobilfazınyatamamınıveyabüyükbirkısmınıortamdanuzaklaştırmaktır. 2) Kütlespektrometresindeanalizgazfazındameydanagelmektedirvekütlespektrometresinegazfazındanumuneningeçmesigerekir. YPSK ileayrılanmaddelerinbirkısmıuçucudeğildirvebazenuçucu hale getirmekamacıylaısıtılırkenbozunabilirler. Bu nedenle EI veya CI yöntemleriuygunolmayabilir. Günümüzdebusorunuçözmekiçindeğişikiyonlaştırmatekniklerigeliştirilmiştir. YPSK dakidedektörpasiftiryaniherhangibiretkileşmeyegirmez, numunekimyasıdeğişmezsadeceölçümyapar. Halbukikütlespektrometresiaktifbirdedektördür. Çünküiçerisindenumunegazfazınageçer, iyonlaşırvedetekteedilir.

  37. REFERANSLAR: • Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA, Principles of Instrumental Analysis, Harcourt&BraceCompany, USA, 1998. • Khan JI, Kennedy TJ, ChristianJr DR, Basic Principles of ForensicChemistry, Springer, New York, USA, 2012. • Hage DS, Carr JD, AnalyticalChemistryandquantitativeanalysis, PearsonPrenticeHall, New Jersey, USA,2011. • Onur F, Analitik Kimya II, Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Yayın No:101

More Related