Karin v argov erika ku mov tom stopka a dal
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 42

Karin V argov á , Erika Kužmová , Tom áš Stopka , a další PowerPoint PPT Presentation


  • 92 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Modely patologických stavů na zvířatech . Karin V argov á , Erika Kužmová , Tom áš Stopka , a další. blokový seminář. u pozorn ění: t a to prezentace (verze PPT, PDF, či jiná ) není oficiální studijní materi á l. Obsah přednášky. zvířecí modely a jejích využití modelové organizmy

Download Presentation

Karin V argov á , Erika Kužmová , Tom áš Stopka , a další

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Karin v argov erika ku mov tom stopka a dal

Modely patologických stavů na zvířatech 

Karin Vargová, Erika Kužmová,

Tomáš Stopka, a další

blokový seminář

upozornění: tato prezentace

(verze PPT, PDF, či jiná)

není oficiální studijní materiál


Obsah p edn ky

Obsah přednášky

  • zvířecí modely a jejích využití

  • modelové organizmy

  • myší modely onemocnění

    - přirozené

    - indukované

    - transgenní modely


Vyu it zv at jako mode l

Využití zvířat jako modelů

  • první písemní zmínky – Řecko 2st. (pitvy, vivisekce, experimentování)

  • mnohé naše znalosti anatomie a fyziologie

  • do 70-tych let experimenty také na lidech

    (vojáci, vězni, mentalně zaostalí)

  • etické hledisko

  • snahy minimalizovat (3Rs - Refine, Reduce, Replace)

  • buněčné kultury a linie, matematické modelování, ...

    „In vivo veritas“


Zv ec modely v biomedic n

Zvířecí modely v biomedicíně

  • základní výzkum mechanizmů onemocnění

  • vývoj nových terapeutických strategií

  • vývoj a objev léčiv

  • předklinické studie

  • testováni toxicity

  • vývoj nových zvířecích modelů dle potřeby a zájmu


V b r vhodn ho modelu

Výběr vhodného modelu

  • vhodný na sledování zvoleného onemocnění

  • reaguje podobně jako člověk

    (založené na základě evidence, nebo biologické similarity, čím základnejší biologický proces tým vyšší předpoklad, že člověk a zvíře budou reagovat podobně)

  • správný design experimentu

    (demonstrace odpovědi, vhodná velikost, délka života, adekvátní kontroly, dostatečné množství zvířat - statistické vyhodnocení)

  • mnohé modely jsou vysoko specifické

  • validace modelu (např. nové léčivo v klinické studii)


Po adavky na ide ln modelov organizmus

Požadavky na ideální modelový organizmus

a) biologické

  • dostupnost, možnost chovu v laboratorních podmínkách

  • dostatečně rychlý vývoj

  • nekomplikovaný životní cyklus

  • produkce většího množství potomků

    b) metodické

  • možnost genetických manipulací (křížení, náhodná a

    cílená mutageneze, reverzní genetika)

  • velikost, životnost

  • dostupnost sekvenčních dat

  • možnost transgeneze


Vybran modelov organizmy

Vybrané modelové organizmy

Bezobratlí: háďátko(Caenorhabditis elegans)

octomilka(Drosophila melanogaster)

Obratlovci: drápatka (Xenopus laevis)

danio(Danio rerio) zebrafish

kur (Gallus gallus domesticus)

myš(Mus musculus)

potkan (Ratus norvegicus)

králík (Oryctolagus cuniculus)

... psy, kočky, prasata, primáti - opice


H tko caenorhabditis elegans

háďátko(Caenorhabditis elegans)

  • především vývojová biologie

  • přesně definovaný počet buněk a jejich osud, průhledné

  • model studia nikotinové závislosti

  • studium molekulární genetiky stárnutí

  • octomilka(Drosophila melanogaster)

  • především genetické studie

  • množství mutantů a genetických modifikací

  • studováni genetiky poruch srdce a neurodegenerativních onemocnění

  • alternativa k savcům, zrychlení studia a testování terapie


Dr patka xenopus laevis

drápatka (Xenopus laevis)

  • především vývojová biologie, toxikologie

  • studium lidských genů

  • (např. genů mutovaných u cystického onemocnění ledvin,

  • genetické nestabilitě ATM, BRCA1, nebo c-Myc u FANC, ...)

  • danio (Daniorerio)

  • využití: vývojová biologie, onkologie,

  • toxikologie, teratologie, výzkum

  • kmenových buněk, regenerativní medicína, ...

  • regenerace ploutev, kůže, srdce a v larválním stadiu mozku

  • - procesem rediferenciace, demetylace histonů – aktivní

  • stav buněk


Karin v argov erika ku mov tom stopka a dal

kur (Gallus gallus domesticus) -embryo

  • molekulární analýza nádorů, karcinogeneze,

  • angiogeneze, metastáz a virové onkogeneze,

  • přirozená imunodeficience - xenoimplantace nádorů,

  • transplantační experimenty

králik (Oryctolagus cuniculus)

  • výhoda velikost, bioreaktory, operační techniky

  • model aterosklerózy, spontánní mutace lipidového metabolismu, srdečná hypertrofie

  • geneticky podmíněný glaukom


Karin v argov erika ku mov tom stopka a dal

potkan (Ratus norvegicus)

  • větší než myš (více buněk, větší orgány, ...)

  • neurologický model, model hypertenze

  • Spontánně hypertenzní krysy (SHR)

  • model esenciální (primární) hypertenze

  • rozvoj hypertenze ve věku 5–6 týdnů

  • ve věku 40 - 50 týdnů vaskulární komplikace a hypertrofie srdce

  • hypertenze, insulinová rezistence, insulinémie, hypercholesterolémie, hyperlipidémie


My modely pro studium lidsk ch nemoc

Myší modely pro studium lidských nemocí


My mus musculus

myš (Mus musculus)

  • březost cca 20 dní

  • v jednom vrhu v průměru 8 mláďat

  • samice může mít několik vrhů do roka

  • samice pohlavně dozrávají cca po 6 týdnech, samci po 8

  • dožívají se 2-3 roky

  • genom ca 2,6x109, 20 chromozomů v haploidní sadě

  • nevýhoda finanční náročnost

  • jeden lidský rok = cca 14 myších dní


My modely onemocn n

Myší modely onemocnění

  • Přirozené mutace

    SCID (severe combined immunodeficiency

    NOD (non-obese DM-1)

    ob/ob (ob = obézní, přirozená mutace leptinu)

  • Indukované onemocnění

    fyzikálně (chirurgicky narušené)

    - srdečný selháni – cirkulační zkratky

    - jaterní selháni – biliární obstrukce

    chemicky

    - autoimunitní onemocnění – imunizace autoantigenem

    - chemicky indukované záněty

    přenosem buněk (implantace nádorových buněk)

  • Transgenní modely (knock-out, knock-in, např. p53)


Karin v argov erika ku mov tom stopka a dal

Metodické přístupy

  • zajímá nás určité onemocnění/proces a chceme vědět, které geny ho řídí - postup od fenotypu ke genotypu

  • - mutageneze, výběr organizmů s určitým defektem, zpětné hledání genu

  • zodpovědného za daný fenotyp (genetické mapování/sekvenace)

  • zajímá nás určitý gen a chceme vědět, jakou úlohu hraje ve vývoji onemocnění - postup od genotypu k fenotypu

  • - v které části těla/buňkách a kdy je daný gen aktivní?

  • - co se stane, když daný gen poškodíme/odstraníme?

  • - co se stane, když daný gen zapneme jindy než je fyziologické?


M odely vznikl p irozenou mutac od fenotypu ke genotypu

Modely vzniklé přirozenou mutací(od fenotypu ke genotypu)


P irozen mutace vedouc k autoimunitn m onemocn n m

Přirozené mutace vedoucí k autoimunitním onemocněním

Systémové poškození:

NZBxNZW: multiorgánové autoimunitní onemocnění

BXSB: Y vázané autoimunitní onemocnění

MRL lpr/lpr (lympho-proliferation): mutace Fas genu

MRL gld/gld (generalized lymphoproliferative disease): mutace genu Fas-L

Orgánové poškození:

NOD (non-obese diabetic): DM I. typu

C3H/HeJ Bir: colitis


Nod non obese diabetic my i

NOD(non-obese diabetic) myši

  • Model diabetu mellitu I. typu (IDDM)

    - samovolně se u nich rozvíjí autoimunní diabetes

    - incidence závisí na environmentálních faktorech

    - Insulitisv 5. týdnu, Diabetesv 16-30.týdnu

    - postihuje častěji samice (20-100%) než samce (1-65%)

  • Další poruchy:

    - porucha funkce regulačních T lymfocytů (CD4+CD25+)

    - nedostatek a porucha funkce NK buněk

    - porucha funkce komplementu (chybí C5)

    - porucha diferenciace a funkce antigen prezentujících buněk


Nod my i podobnost s lidsk m dm typu 1

NODmyši - podobnost s lidským DM typu 1

  • protilátky proti pankreatickým antigenům

  • autoreaktivní CD4+ a CD8+ T lymfocyty

  • dědičnost je polygenní

    • >20 lokusů (Idd) na 11 různych chromozomech je

      asociováno s onemocněním

      Idd1 lokus, Ch17: nezbytný ale ne postačující pro vznik symptomatického DM u NOD myší

      • je zde kódován MHC II protein


Indukovan m odely onemocn n

Indukované modely onemocnění


Imunizace susceptibiln ch kmen autoantigenem

Imunizace susceptibilních kmenů „autoantigenem“

  • Experimentální autoimunitní encephalomyelitis (EAE)

    • Myelin basic protein (MBP)

    • Proteolypid protein (PLP)

    • Myelin oligodendrocyte protein (MOG)

  • Experimentální myastenia gravis (EMG)

    • Torpedo AChR

  • Experimentální arthritis

    • Kolagen typ II

    • HSP

  • Experimentální uveoretinitis

    • S-antigen

    • IRBP


  • Karin v argov erika ku mov tom stopka a dal

    Experimentální asthma bronchiale imunizace dendritickými buňkami s ovalbuminem (OVA-DC) později inhalace OVA aerosolu

    Zdravá plíce

    Plíce po imunizaci a inhalaci OVA

    perivaskulární a peribronchiální

    eozinofilní infiltráty

    „pohárkové buňky“ hyperplazie

    Lambrecht B.N., J Clin Invest, vol. 106, pp. 551-559


    Experiment ln insulitis u balb c my imunizace s st inzul nu peptid 9 23 a p oly ic adjuvant

    Experimentální insulitis u Balb/c myšíimunizace s částí inzulínu peptid (9-23) a poly-IC (adjuvant)

    Tetanus toxoid plus PolyIC

    bez patol. nál. , bez zánětu

    a

    B:9–23 imunizace pankreas bez patol. nál. , bez zánětu

    b

    B:9–23 plus PolyIC

    zánět, Langerh. ostr. poškozené

    d

    B:9–23 plus PolyIC

    zánět, Langerh. ostr. poškozené

    c

    PNAS 99:5539-5544


    Indukce onemocn n p enosem bun k imunodeficientn kmeny model kancerogeneze

    Indukce onemocnění přenosem buněkImunodeficientní kmeny - model kancerogeneze


    Nu nu m y i 19 62

    Nu/Nu myši – 1962

    • gen identifikován 1994 – spontánní delece Foxn1

    • Defektní vývoj thymu vede k defektu:

      • produkce protilátek

      • buňkami-zprostředkovaná imunitníodpověď

      • hypersezitivitapozdního typu

      • zničení virem infikovanýchnebo maligních buněk

      • odmítnutí transplantátu/štěpu

    • Model je používán při studiu solidních tumorů

      • před objevením holých myší byly lidské nádory inkubovány v imunologicky privilegovaných oblastech (přední komora oka, mozek, lícní kapsa)


    Scid prkdc s cid m y i

    SCID (Prkdc/Scid) myši

    • 1983 (Blunt et al., PNAS 1996)

    • homozygotní mutace genu pro Protein kinase DNA-activated catalytic polypeptid

      • DNA-dependentní protein kináza

        • aktivovaná zlomy v dvoušroubovici DNA

        • nezbytná pro vytvoření místa pro vazbu antigenu na molekule imunoglobulinu a receptoru T-buněk

          • defekt při rekombinaci V(D)J fragmentů

        • blok v diferenciaciT a B lymfocytů

      • Nízká schopnost opravovat zlomy v DNA

        • zvýšené riziko vzniku rakoviny (lymfom)


    Scid m y i

    SCID myši

    • Podobné projevy jako lidský SCID

      • >50% lidských SCIDsje X-vázaných

      • mutace ADA, IL2R společného γ-řetězce

    • Studium maligních nádorů

      • implantace lidských nádorových buněk

    • Hostitel tkáně lidského imunitního systému- studie HIV

    • Nevýhody

      • „Leaky phenotype“ (děravý fenotyp) – hladiny imunoglobulinů se zvyšují s věkem

      • krátká doba života (~ 6 měsíců)


    Transplantace xenotransplantace bun k

    Transplantace/xenotransplantacebuněk

    • Transplantace imunokompetentních buněk (syngenní imunodeficientní příjemci)

      multiorgánové chronické zánětlivé onemocnění

    • Transplantace syngenních nádorových buněk

    • Xenotransplantace lidských nádorových buněk (NOD/SCID-IL2Rgamma null = NOG)


    Transgenn modely od genotypu k fenotypu

    Transgenní modely (od genotypu k fenotypu)


    Transgenn zv ata

    Transgenní zvířata

    • 1974 Rudolf Jaenisch

      (první transgenní zvíře)

    • technika rekombinantní DNA (ne přirozeně)

    • využití – sledováni funkce GOI (gene of interest) v tkáních/onemocněních

      - knock-out modely (KO)

      - modely s overexpresí sledované alely

      - knock-in modely (KI)

      - KO modely regulačních nebo jinak důležitých genů vůči GOI

      - kříženci s jinými myšími modely (vzrůstá jejich komplexita)


    Tvorba transgen ho zv ete

    Tvorba transgeního zvířete

    B)

    • mikroinjekce DNA do pronukleu zygoty (obyčejně samčí) – vznik transgení myši

    • injekce ES buněk do blastocyst

      vnik chimérických myší

    • zavedení embryi do

      pseudopregnantních samic

    • vzniknou

      chimérické myši s mutací nebo delecí

      heterozygotní myši (+/-) (+/Δ) s mutací nebo delecí

      homozygotní myši (-/-) (Δ/Δ) s mutací nebo delecí


    Vytvo en kondicion ln ho knock outu

    Vytvoření kondicionálního knock-outu

    Příprava konstruktu (in vitro)

    Elektroporace ES buněk (např. z kmene 129S2– donor strain – „agouti“ - hnědé)

    Homologní rekombinace v ES buňkách

    Selekce ES buněk

    - pozitivní (NEO) neomycin, geneticin

    - negativní (HSV1-TK1) ganciklovir – nespravně inkorporován plasmid

    Ověřeni PCR/Southern blotem

    Odstranění NEO kazety

    Heterozygotní embryonální buňky injikované do blastocyst (např. kmene C57BL/6J (background strain – “blacky”)

    Genotypování mláďat - DNA z chvostu a opět ověření PCR/Southern blotem pomocí prob k specifickým fragmentům

    Křížení s Cre rekombinantním jedincem a vytvoření knocout alely


    My modely li fraumeny syndromu

    Myší modely Li-Fraumeny syndromu


    Li fraumeni syndrom lfs

    Li–Fraumeni syndrom (LFS)

    • vzácná autozomálně dominantní vrozená predispozice k rakovině asociovaná s mutací genu TP53

    • SBLAsyndrom (sarcoma, breast, leukemia, adrenal glad); také nádory mozku - glioblastomy, plic, kostní sarkomy a lymfomy

    • spektrum mutací TP53je podobné somatickým mutacím u sporadických nádorů

    • risk vzniku rakoviny (kromě rakoviny kůže) je 50% do 30 let a 90% do 70 let, celkově 100%u žen a 73% u mužů


    Karin v argov erika ku mov tom stopka a dal

    p53

    • transkripční faktor „strážce genomu“

    • tumor supresorový protein

    • mutace - nejčastěji pozorovaná genetická anomálie v lidských rakovinotvorných buňkách

    • reguluje buněčnou odpověd na cytogenotoxický stres a DNA poškození (UV a ionizující záření, hypoxi, nutriční stres, ...)

    • indukuje opravu DNA poškození, zástavu buněčného cyklu v G1/S/G2 fázy, inhibici angiogenezy a tvorby metastáz, apoptózu a buněčnou senescenci

    DNA binding domain

    sekvence kodonů

    struktura proteinu p53 a frekvence mutaci ve vztahu k funkčním doménam proteinu v lidských nádorech


    Karin v argov erika ku mov tom stopka a dal

    Myší modely ve vztahu k p53 I.

    • první model overexprese p53 (A135V) Lavigeur et al. 1989

    • modely deficientní na p53 Donehower et al. 1992, Jacks et al. 1994

    • - oba modely - zvýšená náchylnost ke vzniku nádorů

    • - p53 není nezbytné pro normální vývoj organizmu

    Donehower & Lozano 2009 Cancer


    Karin v argov erika ku mov tom stopka a dal

    Myší modely ve vztahu k p53 II.

    mouse p53m

    mouse p53 A135V

    p53 super

    Swap p53


    N p53 model

    náš p53 model

    Nomenklatura: B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J

    129S2 – donor strain – “agouti”; C57BL/6J(background strain – “blacky”)

    transformation related protein 53; targeted mutation 1

    The Jackson Laboratory; Tyj Dr. Tyler Jackset al. 1994 Current Biology

    p53-/-

    Křivky vzniku nádorů a přežívání p53-/- p53+/- a wt

    Distribuce nádorů u p53+/- ap53-/- mutantů

    Jacks et al. 1994 Current Biology


    Podobnost my ch model s lfs

    Podobnost myších modelů s LFS

    • - u 20% LFS je nefunkční alela p53 – KO mutace

    • zbytek hot-spot mutaceR175H and R273H (u myší R172H and R270H)

    • avšak nádory mléčné žlázy se u těchto mutantů vyskytují s nízkou frekvencí

    • vliv genetického pozadí

    • C57BL/6 vs. Balb/c

    • Balb/c p53+/– – u 55% samic nádory mléčnéžlázy, více “LFS-like”


    V znam biologick ch model v patofyziologii nemoc

    Význam biologických modelů v patofyziologii nemocí

    • objasnění vlivu genů a epigenetických faktorů v patogenezi choroby

    • identifikace genů zodpovědných za modifikaci klinických příznaků choroby

    • potvrzení/vyvrácení vlivu faktorů okolního prostředí na vznik choroby

    • objasnění regulačních mechanismů

    • testování nových léčebných postupů

    • zavedení nových diagnostických postupů


    Linky na instituce poskytuj ci zv ec modely

    Linky na instituce poskytujíci zvířecí modely

    Charles River laboratories

    http://www.criver.com

    The Jackson laboratory

    http://www.jax.org/

    U nás: Anlab, Velaz

    http://www.anlab.cz; http://www.velaz.cz/


    Jmeno prijmeni@lf1 cuni cz

    Děkuji za pozornost

    [email protected]


  • Login