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第十一章

第十一章. 新技术和新进展 New technique & New progress. 第一节. 重组 DNA 技术 R ecombination DNA Technology. 一 DNA 重组的概念. 生物技术工程包括 : 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等. 基因工程 ---- 实现基因克隆所采用的方法 及相关的工作称基因工程 , 又称 重组 DNA 工艺学 。 目的 ① 分离获得所需要的基因或 DNA 序列； ② 获得所需要或有价值的基因表达产物 ( 蛋白质 ).

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Presentation Transcript

  1. 第十一章 新技术和新进展New technique & New progress

  2. 第一节 重组DNA技术 RecombinationDNATechnology

  3. 一DNA重组的概念 生物技术工程包括:基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等 基因工程----实现基因克隆所采用的方法 及相关的工作称基因工程, 又称重组DNA工艺学。 目的① 分离获得所需要的基因或DNA序列； ② 获得所需要或有价值的基因表达产物(蛋白质)

  4. 相关概念 • DNA克隆 • 工具酶 • 目的基因 • 基因载体 • 基本原理 目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 外源基因与载体的连接 DNA导入受体菌 重组体的筛选 克隆基因的表达

  5. 二、 DNA克隆 应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子( 复制子replicon)，继而通过转化或转染到宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量的DNA分子。 也称基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)

  6. 简单地说 1.克隆（clone）：纯的无性繁殖系统 2.纯化繁殖DNA就称为DNA克隆（DNA cloning）或分子克隆 （molecular cloning） 3.基因的纯化繁殖就称为基因克隆（gene cloning） 4.体外重组DNA的基本程序 如下图；

  7. 重组DNA技术简单概括为： “分、切、接、转、筛” 1、目的基因的获取 2、基因载体的选择与构建 3、目的基因与载体的拼接 4、重组DNA分子导入受体细胞 5、筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子 （转化子）

  8. 以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程

  9. 三、 工具酶 • 限制性核酸内切酶 • DNA聚合酶I • 逆转录酶 • T4DNA 连接酶 • 碱性磷酸酶 • 末端转移酶 • Taq DNA聚合酶

  10. G CCTAG GGATCC CCTAGG GATCC G • 限制性核酸内切酶 • (restriction endonuclease , RE) 定义： 识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围 切割双链DNA的一类内切酶 BamHⅠ + 分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

  11. GGATCC CCTAGG Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构 5’ 5’ 切口：平端切口、粘端切口

  12. BamHⅠ HindⅡ GGATCC CCTAGG GTCGAC CAGCTG G CCTAG GATCC G + GTC CAG 粘端切口 GAC CTG + 平端切口

  13. 几种最常用的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点 BamH I G↓GATCC Cla I AT↓CGAT EcoR I G↓AATTC Hind Ⅲ A↓AGCTT Hind Ⅱ GTPy↓PuAC Kpn I GGTAC↓C Not I GC↓GGCCGC Pst I CTGCA↓G Sal I G↓TCGAC Sau3A I ↓GATC Sfi I GGCCNNNN↓NGGCC Sma I CCC↓GGG Xba I T↓CTAGA Xho I C↓TCGAG

  14. DNA重组技术中最常用的工具酶 酶 主 要 用 途 限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列，切断DNA链 DNA聚合酶I ①缺口平移制标记DNA探针 或其大片段（Klenow） ②合成cDNA的第二链 ③填补双链DNA3¹凹端 ④DNA序列分析 耐热DNA 聚合酶链反应（PCR） （如：Taq DNA）聚合酶 DNA连接酶 连接两个DNA分子或片段 多核苷酸激酶 催化多核苷酸5¹羟基末端磷酸化，制备末 端标记探针 末端转移酶 在3¹末端加入同质多聚物尾 磷酸酶 切除核酸末端磷酸基 SI核酸酶、绿豆核酸酶 降解单链DNA或RNA，使双DNA突出端变为平端 DNA酶I 降解DNA，在双链DNA上产生随机切口 RNA酶A 降解除RNA

  15. 四、目的基因 • cDNA（DNA） • 基因组DNA

  16. （一）目的基因序列的来源和分离 • 化学合成法要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列； • 基因组DNA（G－文库） 基因组DNA文库(genomic DNA library) • cDNA cDNA文库(cDNA library)（C－文库） • 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)

  17. 1.基因组DNA文库 从生物组织细胞提取全部DNA，用物理方法（超声波、搅拌剪力等）或酶法（限制性核酸内切酶的不完全酶解）将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体（常用噬菌体、粘粒或YAC载体）连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集体，就称为基因组DNA文库（genomic DNA library），如下图：

  18. 组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶 基因片断 克隆载体 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。 重组DNA分子 受体菌 含重组分子的转化菌

  19. 2. cDNA文库 • 以mRNA为模板，经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序列与mRNA互补，称为互补DNA或cDNA(complementaryDNA)； • 提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段CDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合体称为该组织细胞的cDNA文库（cDNA library）。

  20. 3.聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction ，PCR） • PCR是一种模拟天然DNA复制过程的选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法； • PCR也称体外酶促基因扩增，原理类似天然DNA复制； • 理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106-109倍，从而大大提高了对其进行分析研究的速度。

  21. (1)PCR反应体系 • 目的基因或序列DNA模板； • TaqDNA聚合酶； • 一对脱氧寡核苷酸引物（primers） • DNA合成所需要的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs） • 保证聚合酶催化反应的Mg2+及缓冲液等。

  22. (2) PCR反应系统的组成 1．耐热DNA聚合酶（Taq酶）：这是由耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可保证在950C，30分钟以上不会变性失活。 2．模板DNA：即待分析的目的DNA，其长度不宜大于10kb。 3．一对脱氧寡核苷酸引物（primers）：为了保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补模板DNA链的3`-端。 4．DNA合成所需要的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）：用作底物的dNTPS。 5．缓冲溶液：保证聚合酶催化反应的Mg2+及缓冲液等。

  23. (3)PCR基本原理 1.在加热条件下，DNA双螺旋解开； 2.在退火温度条件下，引物同模板结合； 3.在TaqDNA聚合酶，Mg2+及合适的缓冲液存在条件下，引物按碱基互补配对原则向3‘方向延伸，至此第一轮PCR反应完成，靶基因由1增加2个重复上述变性。 4.变性、退火、引物延伸重复20-30个循环，靶基因拷贝数以指数形式增加至上百万倍。从而达到扩增核酸靶基因的目的。

  24. PCR的反应原理

  25. (4) PCR的引物设计 PCR扩增产物的特异性主要由引物决定，引物的设计是PCR成功的关键： • 引物位置和产物长度 根据不同目的和要求确定，长度一般在200～800bp之间 • 引物的长度 一般为18～25bp • 末端核苷酸 3’端不得有任何修饰 • G＋C含量和Tm值 一般在40－60%之间，两条相差2－3 ℃

  26. (5) PCR的主要步骤 • 模板DNA的变性：一般选用95℃左右1min，使DNA 双链解为单链； • 复性：按引物实际情况确定适当温度，时间一般30s至1.5min； • 延伸：一般72℃ 1min； • 循环数： 按初始模板浓度确定，一般25－45之间。

  27. (6) PCR的主要用途 目的基因的克隆 PCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有： ① 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板，获得已知的目的基因； ② 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有同源性的DNA片段； ③ 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。

  28. 基因的体外突变 • 采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。 DNA的微量分析 • 由于PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量DNA的分析检测。

  29. 四、 基因载体 定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA

  30. 克隆载体(cloning vector)-----为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体 表达载体(expression vector)-----为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体

  31. 载体的选择标准 • 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。

  32. 质粒（plasmid）的特点 • 细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子； • 质粒是基因工程中最常用的运载体； • 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒； • 存在于许多细菌及酵母菌等生物中； • 质粒的存在对宿主细胞无影响； • 质粒的复制只能在宿主细胞内完成。

  33. 五、外源基因与载体的连接 1、粘性末端连接 方式：同一限制酶切割位点连接 配伍末端连接

  34. 2、平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 3、同聚物加尾连接 由末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。

  35. 4.人工接头 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

  36. 人工连接头及其应用

  37. 六、重组DNA导入受体菌 受体菌条件: 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态 导入方式：转化 (transformation) 转染 (transfaction) 感染 (infection)

  38. 重组体的筛选 直接选择法： 抗药性标记选择 插入失活法 标志补救 分子杂交法原位杂交 Southern印迹 非直接选择法： 免疫学方法如免疫化学方法 酶免检测法

  39. 原 位 杂 交

  40. （二）影响在大肠杆菌中表达外源基因的因素 • 载体因素 • 质粒的拷贝数 • 启动子的强弱 • SD序列及其周围序列 • 终止序列 • 基因因素 • 对质粒增殖的影响 • 5‘端序列的GC含量及与SD序列的互相影响 • 宿主菌因素 • 蛋白酶突变菌株

  41. 七、重组DNA技术应用 • 疾病基因的发现与克隆 • 生物制药 • 基因诊断 • 基因治疗 • 遗传病的预防

  42. 第二节DNA序列测定

  43. 测序原理 DNA链上各脱氧核苷酸的排列顺序的确定 １.DNA polymerase作用下的引物延伸 ２.特异性的链终止。 ３.区别单碱基长度的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 方法：Sanger双脱氧链末端终止法; Maxam-Gilbert化学降解法。

  44. （一）Sanger双脱氧链末端终止法 • 原理：DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。

  45. 基本原理 • DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。 • 在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。

  46. 基本步骤： 　　１．制备单链模板DNA 　　２．模板与引物的结合（退火） 　　３．DNA链的延伸及终止 　　４．电泳 　　５．放射自显影 　　６．读片

  47. 酶法测序的步骤图示

  48. 判读DNA序列的方法

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