实验三 血清补体总活性测定
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实验三 血清补体总活性测定 —— CH50 试验 - PowerPoint PPT Presentation


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实验三 血清补体总活性测定 —— CH50 试验. 补体 :一组存在于人和脊椎动物血清中及组织液中具有酶样活性,不耐热和功能上连续反应的糖蛋白,是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件,在正常情况下,血清中的补体大多以 无活性酶前体 形式存在。. 物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。 灭活: 56℃ 加热 30min 即可灭活. 补体 系统 的生物学功能. ( 1 ) 溶菌和溶细胞作用 :补体系统激活后,在靶细胞表面形成 MAC ,从而导致靶细胞溶解。

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  • 补体:一组存在于人和脊椎动物血清中及组织液中具有酶样活性,不耐热和功能上连续反应的糖蛋白,是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件,在正常情况下,血清中的补体大多以无活性酶前体形式存在。



补体物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。系统的生物学功能

  • (1)溶菌和溶细胞作用:补体系统激活后,在靶细胞表面形成MAC,从而导致靶细胞溶解。

  • (2)调理作用:补体激活过程中产生的C3b、C4b、iC3b都是重要的调理素,可结合中性粒细胞或巨噬细胞表面相应受体,因此,在微生物细胞表面发生的补体激活,可促进微生物与吞噬细胞的结合,并被吞噬及杀伤。


  • 物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。3)引起炎症反应:在补体活化过程中产生的炎症介质C3a、C4a、C5a。它们又称为过敏毒素,与相应细胞表面的受体结合,激发细胞脱颗粒,释放组胺之类的血管活性物质,从而增强血管的通透性并刺激内脏平滑肌收缩。C5a还是一种有效的中性粒细胞趋化因子。


  • 物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。4)清除免疫复合物:机制为:①补体与Ig的结合在空间上干扰Fc段之间的作用,抑制新的IC形成或使已形成的IC解离。②循环IC可激活补体,产生的C3b与抗体共价结合。IC借助C3b与表达CR1和CR3的细胞结合而被肝细胞清除。


  • 物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。5)免疫调节作用:①C3可参与捕捉固定抗原,使抗原易被APC处理与递呈。②补体可与免疫细胞相互作用,调节细胞的增殖与分化。③参与调节多种免疫细胞的功能。


补体激活的途径:物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。

  • 经典途径

  • 旁路途径

  • MBL途径

    相同点:三条途径有共同的末端通路,即形成膜攻击复合物溶解细胞。


1物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。、补体经典途径(classical pathway):是指以抗原抗体复合物为主要刺激物,使补体固有成分以C1、C4、C2、C3、C5~C9顺序发生酶促连锁反应,产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。


  • 2物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。、替代途径(旁路途径):是指不经C1、C4、C2活化,而是在B因子、D因子和P因子参与下,直接由C3b与激活物结合启动补体酶促连锁反应,产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。在感染早期可为机体提供有效的防御机制。其激活物是病原微生物等提供接触表面


  • 3物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。、MBL途径:在感染早期,体内分泌甘露聚糖结合凝集素(MBL)和C反应蛋白。MBL与细菌表面的甘露糖残基结合,然后与丝氨酸蛋白酶结合形成MASP(MBL相关的丝氨酸蛋白酶),MASP继而水解C4和C2启动后序的酶促连锁反应,产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。激活物(或激活剂)是炎症期产生的蛋白和病原体。


三条途径的区别见下表 物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。


补体的来源、采集物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。

  • 实验室常用豚鼠、兔的新鲜血清作为补体的来源。

  • 补体的采集:一般选用3-5只健康未妊娠的豚鼠或兔子,以无菌操作采集血液,采集好的血液置4℃冰箱过夜,次日离心分离血清即可分离到补体。


  • 溶血素(抗绵羊红细胞抗体):是以物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。SRBC作为抗原免疫家兔所得到的兔抗血清,无需进一步提纯,但试验前应先56℃加热30min或者60 ℃3min灭活补体。

  • 溶血反应:由于抗原(红血球)和抗体(溶血素)进行特异性的结合,在电解质存在时能发生凝集,若再有补体参与,红血球则被溶解。


一、目的要求物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。

  • 掌握CH50试验原理。

  • 掌握CH50试验方法。


二、实验原理物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。

抗绵羊红细胞抗体(溶血素)与绵羊红细胞结合后可激活补体,导致绵羊红细胞溶解。其溶血程度和补体量成正相关,但非直线相关。以补体量作为横坐标,溶血百分数作为纵坐标,可得到一个清晰的“S”形曲线。

S型曲线在30%~70%之间最陡,几乎呈直线,补体量的少许变动会造成溶血程度的较大改变,在50%溶血时最为敏感。故常以50%溶血度作为反应的终点指标,所测补体量较为准确,这一方法称为补体50%溶血实验(CH50)。

50%溶血试验即求得能使50%致敏羊红细胞发生溶血的最小量血清,然后计算出每毫升血清中补体含量。


三、材料和试剂物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。

  • 巴比妥缓冲液(BB液)、2%绵羊红细胞悬液、溶血素(2U)、被检血清(新鲜豚鼠血清)

  • 水平离心机、水浴箱、酶标仪等。


四、方法和步骤物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。

1.制备1:20待测血清。

2. 制备50%溶血标准管,随试验一起温育。

1)全溶管:2%SRBC 0.5ml+ ddH2O 2.0ml,

2500rpm 10min,待用

2)50%溶血标准管:

1.25ml全溶管上清+1.25mlBB液,混匀备用


4.物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。将1~10号管所测OD值均和标准管比较,以OD值最接近标准管的那一管定为最高有效反应管,按下面公式计算总补体活性单位:

总补体活性(U/ml)=血清稀释倍数/引起50%溶血管血清用量


五、注意事项:物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。

1.待测标本应无溶血,无污染。

2.受检血清应新鲜,室温放置不能超过2小时。

3.不能立即送检的要立即分离血清-20℃保存。

4.SRBC、缓冲液应新鲜配制,吸取SRBC时应不断轻摇。

5.配制2%SBC、溶血素时要尽可能标准化和准确。


六、结果及讨论物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。

1.结果报告

2.结果分析

  • 补体增高:急性炎症、感染、组织损伤、肿瘤等;

  • 补体降低:见于补体损耗过多,如急性肾小球肾炎、SLE、RA等自身免疫性疾病活动期,大面积烧伤、大出血,慢性肝炎、肝硬化、肝癌等。


七、思考题物理性质:不稳定,易受各种理化因素的影响,加热,紫外线照射,机械震荡,酸碱和酒精等因素均可破坏补体。

简述CH50试验的方法学评价。


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