生化检验技术基础与进展

上海长征医院实验诊断科 于嘉屏生化检验技术基础与进展

1．比色分析理论――Beer-Lambert 定律 A = lg（I0/I）＝KCL 或 I＝I0×10-KCL I0：入射光强度 I：透过光强度 K：常数 C：溶液浓度 L：溶液的厚度一、比色分析

（1）郎伯定律 I0 It l L -dI∝Idl， -dI＝aIdl， dI/I=-adl 积分 It L dI/I ＝ -a dl 得： ln(I0 / It)＝-aL I0 0 将ln改为lg，则为：lg（ I0 / It）＝-0.434aL＝K’L 令lg（ I0 / It）＝A，则A＝ K’L

（2）比尔定律 A＝K”C （3）郎伯-比尔定律 A＝KLC

透光率（transmittance，T，透射率） T＝I / I0 吸光度（absorbance，A）光密度（eptical density，D或OD） A＝lg I0/I＝-lgT T＝10-A＝10-KCL A＝KCL 当L用cm，C用mol/L表示，则K即称之为摩尔吸光系数，用ε表示。当C＝1mol/L，L＝1cm，则ε＝A。

T％与A的关系 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－透光率（T）吸光度（A）－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 1 0.000 0.75 0.125 0.5 0.301 0.25 0.602 0.17 0.770 0.1 1.000 0.05 1.301 0.01 2.000 0.001 3.000 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

2．影响因素 （1）化学因素的影响溶液中溶质可因浓度的改变而发生离解、缔合，与溶剂间的作用等原因而出现偏离比尔定律的现象。由化学因素引起的偏离，有时可控制溶液条件设法减免。此外，能产生荧光的物质也可导致偏离比尔定律。

（2）非单色光的影响 比尔定律的一个重要条件是单色光，但在比色分析中常有不同波长的光同时存在。这就使吸光度发生改变，从而偏离比尔定律。

波长(nm) 颜色被测溶液颜色 750~800 深紫深绿 610~750 深红绿色带蓝 595~610 桔红蓝色带绿 580~595 深黄紫蓝 560~580 绿色带黄青紫 500~560 暗绿深紫 490~500 绿色带蓝深红 480~490 蓝色带绿桔红 435~480 紫蓝深黄 400~435 青紫绿色带黄 200~400 紫外 Ultra-violet 波长的选择可见

（3）光学因素的影响 散射是向空间各个方向，而使透射光减弱。反射可使光能损失，当光线通过两种不同介质时，则发生反射。当样本溶液与空白溶液的折射率有较大差异时，导致吸收值的偏差。（4）非平行光通过吸收池时，由于光线的倾斜使厚度L增大而影响测量值。

（1）仪器误差 滤光片，狭缝过宽，光电池疲劳，仪器结构，散热不良。（2）方法误差（3）操作误差 3．比色法的误差

1. 总蛋白(TP) 蛋白质中的肽键+Cu 2+碱性条件紫红色络合物引起在波长540~560nm范围内吸光度的上升, 与总蛋白含量成正比 2. 白蛋白(ALB) 白蛋白+溴甲酚绿 pH4.2白蛋白溴甲酚绿复合物引起在波长630nm范围内吸光度的上升, 与白蛋白含量成正比比色法举例

1．光源 热光源: 钨灯、卤钨灯（320～2500nm）气体放电光源：氢灯、氘灯（185～375nm）。氘灯发光强度比氢灯强3～5倍，是目前紫外光区常用光源。二、分光光度计

2. 单色器 单色器是一种用来把光源发出的复合光分解成单色光，并能任意改变所需波长的装置。 (1)棱镜玻璃棱镜的折射率大、色散能力也大，因而分辨本领高。但它吸收紫外光，因此只适用于350～3000nm的波长范围。石英棱镜对紫外光吸收少，适用于195-4000nm间分光。但由于石英棱镜折射率低于玻璃，因而色散能力差。

(2)光栅 光栅是利用光的衍射、干涉原理制成的色散元件。目前，全息光栅在质量上，成本上都大大优于机械光栅。因光栅分光在紫外和可见光区均适用，且色散力强、分辨率高，故近年生产的分光光度计大都采用光栅作单色器。

3．比色杯 比色杯可由玻璃和石英等材料制成，玻璃适用于350nm以上光区，而石英杯则适用于紫外和可见光区。

4．检测器 在分光光度计中，把光信号转变成电信号输出的装置称检测器。光电池光电管光电倍增管

双波长分光光度计 来自光源的光被两个单色器分别分离出波长为λ1和λ2的两束单色光。经过折波器后，两束波长不同的单色光交替地照射于同一样品杯。样品杯背后的光电倍增管交替地接收到两种波长照射吸收池后所产生的信号。此信号经电子电路转化为两个吸光度之差△A。

酶法分析包括两方面的内容： ①借助酶来测定某一化合物的浓度，如测定体液中的葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、尿素、尿酸、肌酐等。 ②借助酶来测定另一种酶的活性，实际上是用酶来测定待测酶的产物，如转氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。三、酶法分析

葡萄糖 葡萄糖＋O2＋H2O 葡萄糖氧化酶葡萄糖酸＋H2O2 H2O2＋苯酚＋4-氨基安替比林过氧化物酶醌亚胺＋H2O 尿素尿素＋H2O 脲酶2NH4+＋CO2 NH4+＋α-酮戊二酸＋NADH 谷氨酸脱氢酶谷氨酸＋NAD+＋H2O

肌酸激酶（CK） 磷酸肌酸＋ADP CK肌酸＋ATP 葡萄糖＋ATP HK葡萄糖-6-磷酸＋ADP 葡萄糖-6-磷酸＋NADP G6PDH 6-磷酸葡萄糖酸＋NADPH＋H+ 丙氨酸氨基转移酶（ALT）丙氨酸＋α-酮戊二酸 ALT丙酮酸＋谷氨酸丙酮酸＋NADH＋H+ LDH乳酸＋NAD+＋H2O

高度的特异性 高催化效率作用条件温和酶催化特点

底物结合部位 催化部位酶的活性部位

金属离子 辅基和辅酶 NAD ，NADP 酶的辅助因子

1. 氧化还原酶 2. 转移酶 3. 水解酶 4. 裂合酶 5. 异构酶 6. 合成酶酶的分类

应将酶的一种或两种底物以及催化反应的性质明确标明。应将酶的一种或两种底物以及催化反应的性质明确标明。乳酸脱氢酶 L-乳酸：NAD+氧化还原酶肌酸激酶 ATP：肌酸磷酸转移酶酶的系统命名

一国际单位为在一分钟内催化转变1个微摩尔的反应物的酶量.一国际单位为在一分钟内催化转变1个微摩尔的反应物的酶量. IU→U U/L 1Katal为每秒钟转化1mole底物的酶量 1国际单位=16.67nKatal 1Katal=6×107国际单位酶的活性单位

影响酶活性测定：底物、激活剂、抑制剂、缓冲液、pH、温度、酶浓度。影响酶活性测定：底物、激活剂、抑制剂、缓冲液、pH、温度、酶浓度。在最适条件下以求达到最大的反应速度。但由于底物的溶解度低，或售价太高，或需连锁的酶反应，则必须对测定条件作修正。酶活性测定

合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度指示酶和辅助酶的种类和浓度反应混合液的最适pH，缓冲液种类和浓度去除各种抑制剂酶活性测定的最适条件

反应级数 0级 1级 [P] 1.可逆反应 2.产物抑制 3.酶变性失活 v=dP/dt 4.底物不饱和 [S] 时间 t 酶促反应的两个阶段

酶量[E] 40 1.[E]越大，线性反产应期越短物 2.[E]相同，[S]越小， [P] 20 线性反应期越短 10 5 0 5 10 15 20 时间(min) 酶反应进程和酶浓度曲线

时间(min) 5(t0) 反应时间越短， 10(t1) 线性范围越大 15(t2) 20(t3) 0 10 20 30 40 酶量[E] 酶反应时间曲线

V[S] v = Km+[S] 米氏方程 k k +1 +2 E + S ES E + P k k -2 -1 V [S]　＝ Km v ＝ 2

米氏曲线 Vmax V Vmax 　 2 Km Km Km [S]

米-孟氏公式：v＝Vm[S]/(Km＋[S]) 当[S]<<Km时，v＝(Vm/Km)[S]＝k[S]，呈一级反应。当[S]>>Km时，则v＝Vm，即反应速度是一个常数，为零级反应。如[S]～Km时，混合级反应。米氏常数

如v＝0.5Vm，则Km＝[S]，Km值等于酶促反应的初速度为最大速度的一半时所需的底物浓度。如v＝0.5Vm，则Km＝[S]，Km值等于酶促反应的初速度为最大速度的一半时所需的底物浓度。 Km等于ES的解离常数；而Km的倒数可代表酶和底物的亲和力。 Km是酶的特征性常数，当pH、温度和离子强度恒定时，Km只和酶及底物的性质有关，而与酶浓度无关。纯度不同的同一种酶，如杂质中没有可使底物发生旁反应的其它酶或酶的激活剂和抑制剂，则Km的变化不大。米氏常数的意义

（1）如已知酶的Km，可计算某一底物浓度时的v/Vm。（1）如已知酶的Km，可计算某一底物浓度时的v/Vm。（2）如要求v占Vm一定的百分比，也可算出所需底物浓度为其Km的多少倍。（3）利用工具酶来测定某一底物的浓度时，可计算工具酶的用量。米氏常数的应用

（4）测定几个同工酶对同一底物的Km，可估计是原级（ Km常有差异）还是次生性同工酶（ Km接近或相同）。（5）测定正逆方向底物的Km，可大体知道该酶催化哪一方向为主。（6）如已知一组酶中各酶的Km及其相应底物的浓度，有助于寻找限速步骤。

Lineweaver-Burk作图法 1/v＝(Km/Vm)(1/S)＋1/Vm Eadie-Hofstee作图法 v＝Vm－Km(v/S) Eisenthal和Cornish-Bowden作图法设Y轴和X轴分别为求取Vm及Km的座标，将不同S浓度点在X轴的负侧；相应的反应速度点在Y轴上，连接各线，交点在Y轴上的座标为Vm，在X轴上的座标为Km。 Km的求取

酶活性是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得的。酶活性是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶促反应的速率来获得的。酶活性测定的基本知识

（1）定时法 测定酶反应开始后某一时间内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法称为定时法。产 2 物 3 生 1 成 t1 t2

（2）连续监测法 连续测定（每15s～1min监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法，又称动力学法或速率法。这种方法的优点是可将多点的测定结果连接成线，很易找到成直线的区段，来计算酶活性。此法较为准确。分为直接连续监测法和间接连续监测法。法.

吸光度 △A3 △A2 △A1 t1 t2 t3 t4时间连续监测法的测定时间

（3）平衡法 通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活性的方法称为平衡法。用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反应时间不成线性，故不能把[P]或[S]的总变化量除以t来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆反应等因素的影响，由于反应时间较定时法长，故这种影响会更大，测定结果也较连续监测法低。对于有些零级反应期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。

定时法 条件无限制试剂需量少，经济采用放射性试剂时，灵敏度高结果不能立刻揭晓人工操作多，费时毋需偶联酶产物会生抑制作用连续法因偶联酶使条件受限制需量较大与放射性试剂来比，灵敏度低结果立刻揭晓人工操作少偶联酶的费用很大偶联作用能消耗产物定时法与连续法比较

通过酶偶联反应间接地测出第一个酶促反应中待测物的浓度或待测酶的活性。那些作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。通过酶偶联反应间接地测出第一个酶促反应中待测物的浓度或待测酶的活性。那些作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。（一）工具酶及酶偶联反应

A＋B 酶1 C＋D C（或D）＋E酶2 F＋G F（或G）＋H酶3 I＋J 酶1：待测酶酶2：辅助酶酶3：指示酶 E、H：辅助底物

在利用工具酶的反应中，唯一的限速因子应该是待测化合物或待测酶。在利用工具酶的反应中，唯一的限速因子应该是待测化合物或待测酶。对工具酶试剂中的杂质（杂酶、抑制剂等）的含量也有一定的限制，以减少或避免干扰测定的副反应。

如果工具酶制剂中污染了待测酶会对测定结果产生严重影响。如果工具酶制剂中污染了待测酶会对测定结果产生严重影响。如天冬氨酸转氨酶（AST）测定的工具酶是苹果酸脱氢酶（MDH），如污染0.03%的AST，则当AST活性为7U/L时，测定误差为6%。而测定丙氨酸转氨酶（ALT）的工具酶是乳酸脱氢酶（LDH），如污染0.03%的ALT，则当ALT活性为5U/L时测定误差也是6%。

1．NADH或NADPH： 乳酸脱氢酶（LDH） NAD+或NADP+ 苹果酸脱氢酶（MDH） NAD+或NADP+ 谷氨酸脱氢酶（GLDH） NAD+或NADP+ 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）动物G6PD NADP+ 微生物G6PD NAD+ （二）常用监测物质的特性

生化检验技术基础 与进展