Nukleiinhapped

1. Nukleiinhapped Loeng 12

2. Nukleotiidid, nukleosiidid ja lämmastikalused • DNA ja RNA primaarstruktuur • DNA kõrgemat järku struktuur • RNA kõrgemat järku struktuur • DNA ja RNA hüdrolüüs • Nukleoproteiidsed kompleksid • DNA primaarstruktuuri määramine

3. Nukleiinhapped Nukleiinhapped on molekulid,mille struktuuri kasutatakse geneetilise informatsiooni säilitamiseks DNA- Informatsiooni “Master copy” rakkudes RNA- Otseselt DNA informatsiooni vahendavad molekulid (mRNA), samuti selles protsessis abifunktsioone omavad rRNA, tRNA jt. Keemiliselt on DNA ja RNA sarnased heteropolümeerid põhiahel koosneb suhrujääkidest ja fosfaatidest suhkrujääkide küljes on N-glükosiidse sidemega lämmastikalused

4. Nukleiinhapetes olevad suhkrud Riboos- RNA koosseisus Desoksüriboos- DNA koosseisus

5. Nukleosiidid- ühendid, milles N-glükosiidse sidemega on seotud suhkur ja lämmastikalus Nukleotiidid- nukleosiidide fosfaatestrid

6. Lämmastikalused Lämmastikalused on: -neutraalsed -planaarsed Lämmastikalused on kas puriini või pürimidiini derivaadid Puriinid: kahe lämmatikku sisaldava tsükliga ühendid adeniin ja guaniin nii RNA kui DNA struktuuris Pürimidiinid: ühe tsükliga ühendid, tsütosiin nii RNA kui DNA; tümiin DNA ja uratsüül RNA koosseisus Lisaks kirjeldatutele on olemas rida modifitseeritud või mittestandartseid N-aluseid: N6-metüüladeniin 5-metüültsütosiin N2-metüülguaniin 5-hüdroksümetüültsütosiin Hüpoksantiin Pseudouratsüül 7-metüülguaniin 4-tiouratsüül

7. Nukleosiidide ja nukleotiidide nimetuste moodustamisel lähtutakse lämmastikaluste nimedest Adeniin (N-alus) Adenosiin (Nukleosiid) Adenosiin monofosfaat – (nukleotiid, adenosiini monofosfaatester) desoksünukleosiid- desoksüadenosiin difosfaat, trifosfaat- adenosiin 5´-difosfaat esterifitseeritud OH on 5´ positsioonis kui ei ole spetsiifiliselt näidatud Lämmastikalus nukleosiid Adeniin adenosiin Guaniin guanosiin Tsütosiin tsütidiin Tümiin tümidiin Uratsüül uridiin

8. Nukleotiidid- koensüümide koostisosad FAD

9. Nukleotiidid- makroergilised ühendid Fosfoesterside + H2O Z DG0=-14kJ/mol Fosfoanhüdriidside+ H2O Z DG0=-31kJ/mol

10. Nukleiinhappe primaarstruktuur Nukleotiidid on ühendatud lineaarseks polümeeriks nukleiinhappeks 3´-5´ fosfodiestersidemetega Mononukleotiidid Dinukleotiidid Trinukleotiidid Oligonukleotiidid Polünukleotiidid Kokkuleppeliselt kirjeldatakse RNA ja DNA primaarstruktuuri suunas 5´Z3´. 5´- ATTAGGAACCGG- 3´

11. DNA molekuli suurus varieerub erinevates organismides Lihtsamates organismides on kogu genoomne DNA üks lineaarne või tsirkulaarne molekul Eukarüootsetel organismidel on mitu kromosoomi DNA moodustab kogu raku massist ligikaudu 1% • Organism DNA (bp kokku) konformatsioon • Viirused • SV40 5,100 tsirkulaarne • Adenoviirus 36,000 lineaarne • faag 48,600 tsirkulaarne Bakterid E. coli 4,700,000 tsirkulaarne Eukarüoodid S. Cerevisiae 13,500,500 lineaarsed D. Melanogaster 165,000,000 lineaarsed Inimene 3,000,000,000 lineaarsed

12. RNA RNA moodustab umbes 5-10% raku massist Rakus esineb 3 põhilist RNA liiki Ribosomaalne RNA- assotseerunud valkudega ribosoomide kujul. Ribosoomid on valgu biosünteesi lookused mRNA- valgu biosünteesiks vajaliku informatsiooni vahendaja DNA-lt tRNA- moodustab aminohapetega estreid, mida rakendatakse valgu biosünteesis

13. DNA sruktuuri elemendid DNA kovalentse struktuuri aluseks on põhiahel, mis koosneb vahelduvatest suhkrujääkidest ja fosfaatidest Vahelduvad fosfaadid-suhkrujäägid moodustavad spiraalse heeliksi ümber paardunud lämmastikaluste Kanoonilises DNA struktuuris paarduvad puriin ja pürimidiinalused vastavalt adeniin-tümiin ja guaniin-tsütosiin ja see paardumine hoiab DNA ahelaid koos kaksikheeliksina AT paar-2 vesiniksidet GC paar- 3 vesiniksidet

14. Kaksikheeliksi esimene mudel, välja töötatud Watsoni ja Cricki poolt oli B vormis oleva DNA struktuur B-vorm on füsioloogilistes tingimustes dominantne DNA konformatsioon A-vorm tekib B-vormi keemilisel töötlemisel näiteks alkoholide ja soolalahuste toimel Tuntud on ka vasakpoolse keermega heeliks- Z DNA B-DNA 10 aluspaari ühe täispöörde kohta, A-DNA- 11; Z-DNA- 12 B-DNA heeliks on seest praktiliselt täidetud, 2 aluse vahe (tõus) 0.34nm A-DNA B-DNA

15. DNA kaksikheeliksi struktuuri mudel võimaldas kohe mugavalt tuletada replikatsiooni ja informatsiooni edastamisprotsesside mudelid, mis baseeruvad kaksikheeliksi ajutisel lahtisulamisel, lokaalsel denaturatsioonil DNA kaksikheeliksi ahelaid kooshoidvaid vesiniksidemeid ja van der Waalsi jõude on võimalik katkestada ehk DNA denatureerida termiline töötlus happed, alused orgaanilised solvendid DNA ahelad võivad reassotseeruda denatureeriva faktori eemaldamisel Näiteks- DNA lahuse kuumutamisel ahelad lahknevad. DNA lahuse jahutamisel ahelad reassotseeruvad

16. DNA tertsiaarstruktuur DNA molekul võib olla lineaarne või tsirkulaarne Rõngasmolekulid võivad omakorda olla relakseerunud või superspiraliseerunud konformatsioonis Superspiraalne vorm on väiksema stabiilsusega, ent in vivo on tsirkulaarsed DNA molekulid sageli superspiraalsed Superspiralisatsioon võib olla oluline replikatsiooni ja transkriptsiooni regulatsioonil DNA molekulide topoloogiat muudavad topoisomeraasid

17. RNA struktuuri elemendid RNA funktsionaalne jastrukturaalne erinevus DNA-ga võrreldes baseerub kahel olulisel detailil: 1. RNA struktuuri kuulub riboos ja mitte desoksüriboos 2. RNA struktuuri kuulub lämmastikalus uratsüül ja mitte tümiin Lisa OH rühm suhkru koosseisus muudab RNA hüdrolüüsi suhtes tundevalt labiilsemaks RNA molekul koosneb alati ühest kovalentselt seotud ahelast RNA ei moodusta pikka lineaarset kaksikheeliksi struktuuri RNA molekulid moodustavad sekundaarstruktuure voltudes iseendaga Kirjeldatud on mitmesugused sekundaarstruktuuri elemendid Juuksenõela (hairpin) struktuur Parempoolne kaksikheeliks Sisemised aasad ja paunad- katkestavad sageli pideva kaksikheeliksi

18. tRNA struktuur tRNA molekulid on 74-93 nukleotiidi pikkused tRNA funktrioneerivad kui aktiveeritud aminohapete adapterid valgu biosünteesis Iga aminohappe kohta on vähemalt üks tRNA liik tRNA struktuuri kuulub palju modifitseeritud nukleotiide Kõik tRNA molekulid moodustavad sarnase sekundaar ja tertsiaarstruktuuri

19. rRNA rRNA sekundaar ja tertsiaarstruktuur sisaldavad analoogilisi elemente tRNA molekulile. rRNA molekulid on aga palju suuremad ja seega kompleksema struktuuriga Toodud 16S rRNA primaarstruktuur on sageli aluseks evolutsiooni uurimisel

20. RNA ja DNA ensümaatiline hüdrolüüs nukleaaside toimel Nukleiinhapete struktuuri iseloomustamisel ja funktsiooni analüüsil on sageli vajalik suurte nukleiinhapete molekulide fragmenteerimine Näiteks- primaarstruktuuri analüüsil rekombinantsete DNA molekulide genereerimisel Ajalooliselt 3 meetodit ensümaatiline hüdrolüüs happeline hüdrolüüs (DNA, kaasneb depuriinimine) aluseline hüdrolüüs (RNA)

21. Nukleaasid Ensüümid, mis katalüüsivad fosfodiestersideme hüdrolüüsi Funktsioone- nukleiinhapete degradatsioon kahjustuste, võõr DNA sissetungi korral jm Mõned nukleaasid on DNA või RNA spetsiifilised, mõned järjestusspetsiifilised, mõned mittespetsiifilised DNaas- desoksüribonukleaas, hüdrolüüsib DNA molekule RNaas- ribonukleaas, hüdrolüüsib RNA molekule

22. Nukleaasid Vastavalt hüdrolüüsitava sideme asukohale jaotatakse nukleaasid: Eksonukleaasid- katalüüsivad terminaalse nukleotiidi eemaldamist 3´ eksonukleaasid 5´ eksonukleaasid Endonukleaasid- katalüüsivad internaalse fosfodiestersideme hüdrolüüsi produktiks 3´ fosfaadiga nukleotiid produktiks 5´fosfaadiga nukleotiid

23. Nukleaasid Ensüüm substraat klass spetsiifika Pankrease RNA endo(I) 3´ Pyr ribonukleaas A Põrna DNA, RNA ekso(II) 5´ots, aluse fosfodiesteraas spetsiif. puudub Põrna DNA endo(II) internaalne ester- desoksüribonukleaas side, aluse spetsiif. puudub Maomürgi DNA, RNA ekso(I) 3´ ots, aluse fosfodiesteraas spetsiif. puudub

24. Restriktsiooni endonukleaasid Restriktaasid Järjestusspetsiifilised DNA endonukleaasid Produtseeritakse erinevate bakterite poolt selleks et degradeerida ehk restrikteerida võõr- DNA molekule Peremeesraku DNA on protekteeritud tänu spetsiifilisele metülatsioonile Isoleeritud ja biokeemiliselt iseloomustatud on sadu restriktaase Nomenklatuur- tähis tuletatakse isoleerimiseks kasutatud liigi nimest EcoRI- E. coli tüvest R isoleeritud esimene restriktaas

25. Restriktaasid Enamus restriktaase on kaksikahelalise DNA spetsiifilised Erinevate restriktaaside hüdrolüüsi tulemusena tekkivad molekulide otsad võivad olla erinevate “etteulatuvate” ahelatega Restriktaasid on endo(I) tüüpi nukleaasid DNA fragmentide katalüütiline fragmenteerimine leiab laialdaselt rakendust DNA analüüsil baseeruv identifitseerimine 5´...GGCC... 3´ 3´...CCGG... 5´ 5´...GANTC...3´ 3´...CTNAG...5´ 5´...GAATTC...3´ 3´...CTTAAG...5´ 5´...GGTACC...3´ 3´...CCATGG...5´ 5´...GGATG(N)9...3´ 3´...CCTAC(N)13...5´ HaeIII HinfI EcoRI KpnI FokI

26. Nukleoproteiidsed kompleksid- supramolekulaarsed valkude ja nukleiinhappe kompleksid Viirused Kromosoomid Ribosoomid Ribonukleoproteiidsed ensüümid snRNPs jt Viirused Stabiilsed infektsioossed partiklid, mille koosseisu kuulub nii valk kui nukleiinhape. Valk moodustab kaitsekihi ümber nukleiinhappe. Suuremad komplekssemad viirused sisaldavad täiendava kesta, mis koosneb glükoproteiididest ja membraanilipiididest

27. Kromosoomid Eukarüootsed kromosoomid koosnevad DNA-st, mis on mähitud histoonidest, koosnevate partiklite ümber Histoonid on väikesed aluselised valgud 8 histooni moodustavad nukleosoomiks nimetatava südamiku, mille ümber DNA on mähkunud Moodustunud kompleksi nimetatakse kromatiiniks

28. snRNP- väikesed tuuma ribonukleoproteiidsed partiklid Eukarüootsete rakkude tuumades leiduvad RNAd ja valke sisaldavad osakesed Katalüüsivad RNA protsessingu etappe, seal hulgas on vajalikud intronite eemaldamiseks pre-mRNA koosseisust ehk splaisinguks Ribosoomid- valgu biosünteesi kompleksid Sisaldavad ca 65% RNAd ja 35% valku. Koosnevad kahest dissotseeruvast subühikust Ribonukleoproteiidsed ensüümid Ribonukleaas P ja telomeraas