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实验十一 细菌总 DNA 的提取

实验十一 细菌总 DNA 的提取. DNA 的性质. DNA 、 RNA 和核苷酸都是极性化合物，一般都 溶于水 ，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂； 在酸性溶液中， DNA 、 RNA 易水解，在 中性或弱碱性溶液中较稳定 ； 天然状态的 DNA 是以 脱氧核糖核蛋白 (DNP) 形式存在于细胞核中。要从细胞中提取 DNA 时，先把 DNP 抽提出来，再把 P 除去，再除去细胞中的糖， RNA 及无机离子等，从中分离 DNA 。. 提取细菌 DNA 的常用方法. 提取细菌 DNA 的常用方法. 传统法. 水煮法. 试剂盒法. 菌体水煮后用丙酮沉淀

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实验十一 细菌总 DNA 的提取

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Presentation Transcript

  1. 实验十一 细菌总DNA的提取

  2. DNA的性质 • DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂； • 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定； • 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。

  3. 提取细菌DNA的常用方法 提取细菌DNA的常用方法 传统法 水煮法 试剂盒法 菌体水煮后用丙酮沉淀 费用低、步骤简单、耗时短、无需有机抽提沉淀； DNA量大但纯度较低，且高温使DNA变性无法满足后续需高纯度DNA的分子生物学实验：酶切、PCR、转基因等 裂解液裂解细胞后采用酚氯仿等有机溶剂抽提 最可靠、费用低、操作繁琐、耗时长、DNA产率低、纯度较水煮法高可满足各种临床检测需要 Genomic DNA Kit 法 操作很简便、耗时很短、DNA纯度很高、避免了有机提取液对人的伤害 但量少，不适于大批量DNA的提取，费用昂贵

  4. 一、 实验目的 • 了解常用的细菌总DNA制备的方法和适用范围 • 学习细菌总DNA提取的操作技术

  5. 裂解 二、实验原理 纯化 检测

  6. 1. 裂解细胞： ①机械方法：超声波法、研磨法、匀浆法②化学试剂法：用SDS、盐酸胍等变性剂③酶解法：溶菌酶或蜗牛酶 G+和G-细胞壁组成不同，采用SDS法、盐酸胍法可直接裂解大肠杆菌等G-的细胞。而枯草杆菌是G+，所以在SDS 处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁。溶菌酶是一种糖苷水解酶，它能水解菌体细胞壁的主要化学成份肽聚糖中的β—1，4 糖苷键

  7. 阴离子去污剂法:用SDS或盐酸胍等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，因为阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA。阴离子去污剂法:用SDS或盐酸胍等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，因为阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA。

  8. EDTA: 抑制核酸酶 CTAB: 除多糖 PVPP: 除腐殖酸（用于环境样品）

  9. 2. 去除蛋白 • 蛋白酶K水解蛋白质 • 酚和 氯仿/异戊醇抽提分离蛋白 酚：有效变性蛋白 氯仿：加速有机相和液相的分离 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生气泡

  10. 3. 析出DNA： 乙醇、异丙醇沉淀使DNA 从溶液中析出 • 氯化钠：用于含有SDS的DNA样品 • 醋酸铵：可以去除样品中99%dNTP,用于PCR, RT-PCR等反应 • 氯化锂：沉淀大分子量的RNA,故常用与RNA的沉淀 • 氯化镁：微量DNA的提取（长度小于100bp），但结合的DNA不易溶解，同时在保存过程中易降解，是Mg2+ DNase的激活剂。 。。。。。。

  11. DNA提取的一般流程

  12. 提取总DNA和质粒DNA的区别 提取质粒DNA时，采用碱裂解法。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，通过SDS的洗涤和离心大部分染色体DNA可以被除去。而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。

  13. 要获得大片段的DNA 分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA 分子的可能性； 分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行； 另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。 抽提的注意事项

  14. 检验DNA产物 （琼脂糖凝胶电泳）

  15. 电泳技术 • 电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。 • 把DNA样品加入一块包含电解质的多孔支持介质的样品孔中，并置于静电场中，DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基。 • 当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA片段就会表现出不同的迁移率，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。

  16. 该过程可以通过相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳，然后通过示踪染料EB染色而得到检测。该过程可以通过相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳，然后通过示踪染料EB染色而得到检测。 • EB：3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(Ethidium Bromide，溴化乙锭)。 • 染色机制：EB能插入DNA的碱基对中与DNA结合。 • 显色：EB以590nm波长发射出橙红色荧光。 • 优点：简便、快速、灵敏度高（10ng）

  17. 琼脂糖凝胶电泳 1.称取0.4g agarose（琼脂糖）置于250ml锥形瓶中，加入40ml TAE电泳缓冲液，微波炉中火加热1min至沸，使琼脂糖溶解均匀。 2.待琼脂糖溶液稍稍冷却后，将溶液倒入制胶盘中冷却。 3.冷却30min后，垂直向上拔出制孔梳子，将胶放入电泳槽中，加入TAE电泳缓冲液直至没过胶体，赶出点样孔中的气泡。

  18. 4.在每个点样孔中加入6μl样品，样品的组成为：2μl loading buffer、4μlDNA样品。在最左侧的点样孔中加入双酶切marker样品的组成为：3μl loading buffer、2μl无菌纯水、1μl marker。 5.90V恒压电泳45-50分钟。 6.当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳。

  19. 7.将凝胶放入溴化乙锭（EB）溶液 （0.5g/ml左右）中染色约20min。 8. 观察与拍照: 在紫外灯(310nm波长) 下观察染色后的凝胶。DNA存在处显 示出红色的荧光条带。紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。 UV摄像观察保存。 注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全 操作，必须戴塑料或乳胶手套!!!

  20. 取样：枪尖接触液面 勿伸入底部

  21. 三、实验报告 • 实验结果：记录细菌总DNA电泳的结果 • 思考题 （1）试列举出你了解的几种细胞裂解方法，并解释其工作原理 （2）假设你分离鉴定了一个新菌株，请设计分离制备其总DNA的方法，并说明理由。

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