Dalla sequenza alla struttura
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Dalla sequenza alla struttura. Dalla sequenza alla struttura. VLSEGEWQLVLV . . . O 2. Sequenza Struttura Funzione. Che informazioni offre la struttura?. Conformazione dei siti attivi e di legame Orientazione dei residui conservati Interpretazione di meccanismi Visualizzazione di cavità

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Dalla sequenza alla struttura

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Presentation Transcript


Dalla sequenza alla struttura

Dalla sequenza alla struttura


Dalla sequenza alla struttura1

Dalla sequenza alla struttura

VLSEGEWQLVLV . . .

O2

SequenzaStrutturaFunzione


Che informazioni offre la struttura

Che informazioni offre la struttura?

  • Conformazione dei siti attivi e di legame

  • Orientazione dei residui conservati

  • Interpretazione di meccanismi

  • Visualizzazione di cavità

  • Calcolo di potenziale elettrostatico


Esempio

Esempio

  • FtsZ – divisione cellulare in procarioti, mitocondri e cloroplasti.

  • Tubulina – componente strutturale dei microtubuli – comunicazione intracellulare e divisione cellulare.

  • FtsZ e Tubulina hanno bassa similarità di sequenza e non sembrerebbero omologhe.


Ftsz e tubulina sono omologhe

FtsZ e tubulina sono omologhe?

  • Proteine che hanno conservato la struttura tridimensionale possono derivare da un progenitore comune anche se la divergenza della sequenza non permette più di riconoscere l’omologia.


Dalla sequenza alla struttura

Burns, R., Nature 391:121-123

Picture from E. Nogales


Un altro esempio

Un altro esempio

  • α-lattalbumina e lisozima possiedono:

    • Stesso fold

    • Moderata similarità

    • Diversa funzione


Dalla sequenza alla struttura

ALA

PRO

TRP


Dalla sequenza alla struttura

Esempi di folding:

up-and-down barrel

greek key

jelly-roll


Dalla sequenza alla struttura

Domìni


Struttura quaternaria

Struttura quaternaria


Cristallografia a raggi x

Cristallografia a raggi X

  • Ottenere cristalli della proteina

    • 0.3-1.0 mm

    • Le singole molecole sono ordinate in modo periodico, ripetitivo.

  • La struttura è determinata dai dati di diffrazione.


Diffrazione a raggi x

Diffrazione a raggi X


Dalla sequenza alla struttura

Image from http://www-structure.llnl.gov/Xray/101index.html


Dalla sequenza alla struttura

Schmid, M. Trends in Microbiology, 10:s27-s31.


Dalla sequenza alla struttura

Cristallografia a raggi X

  • Le proteine devono cristallizzare

    • Grande quantità

    • Solubili

  • Accesso a radiazione adatta

  • Tempo di calcolo per risolvere la struttura


Instrumentation

Instrumentation

or synchrotron X-rays


Instrumentation1

Instrumentation

ESRF - Grenoble


Dalla sequenza alla struttura

Instrumentation

Elettra - Trieste


Dalla densit elettronica al modello strutturale

Dalla densità elettronica al modello strutturale

+ =

Densità iniziale Interpretazione Struttura 3D

  • La qualitá delle MAPPE dipende dalla risoluzione.

  • • La risoluzione dipende dalla qualitá dei cristalli.


Risoluzione

Risoluzione


Dalla sequenza alla struttura

NMR

Campo magnetico

NOE (Nuclear Overhauser Effect)


Il campo magnetico

Il campo magnetico

Magnete a 400 MHz

Magnete a 900 MHz

Costo commerciale di uno spettrometro a 900 MHz: ca. 5 M €

n. di spettrometri 900 MHz operativi al mondo < 10


Risonanza magnetica nucleare nmr

Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)

  • Proteine in soluzione

  • Limite di dimensione ~ 40 kDa

  • Proteine stabili a lungo

  • Marcatura con 15N, 13C, 2H.

  • Strumentazione molto costosa

  • Tempo per assegnare le risonanze


Regions of the 1 h nmr spectrum are further dispersed by the 3d fold

Regions of the 1H NMR Spectrumare Further Dispersed by the 3D Fold

What would the unfolded protein look like?


Resolve peaks by multi d nmr

Resolve Peaks By Multi-D NMR

A BONUSregions in 2D spectra provide protein fingerprints

If 2D cross peaks overlap go to 3D or 4D …..


Conformational ensemble representing an nmr structure

C

N

Conformational Ensemble Representing an NMR Structure


Pro e contro

X-ray

Richiede cristalli, problematico

Non ha limiti (teorici) di grandezza

Piú preciso

Risoluzione

Struttura può essere deformata dai cristalli, rigida

Una “soluzione“

NMR

Possibile in soluzione, più semplice

Limitato a proteine fino a circa 300 residui

Meno preciso

Numero di vincoli

Struttura nativa in soluzione, flessibile

Molti modelli

Pro e contro


Dalla sequenza alla struttura

X-ray

NMR


Protein data bank pdb

Protein Data Bank (PDB)

  • URL: http://www.rcsb.org/pdb/

  • Coordinate 3-D di strutture proteiche

  • Formato unico

  • Tutte le strutture risolte con i raggi X e NMR

  • Più vecchia della maggior parte degli altri database

  • Strutturata male a causa dello sviluppo storico


Il protein data bank

Il Protein Data Bank


Crescita del pdb

Crescita del PDB


Motivi strutturali depositati ogni anno

Motivi strutturali depositati ogni anno


Superfamiglie depositate ogni anno

Superfamiglie depositate ogni anno


Formato pdb i

Formato PDB I

HEADER ONCOGENE PROTEIN 06-JUN-91 121P 121P 2

COMPND H-RAS P21 PROTEIN COMPLEX WITH GUANOSINE-5'-[B,G-METHYLENE] 121P 3

COMPND 2 TRIPHOSPHATE 121P 4

SOURCE HUMAN (HOMO SAPIENS) CELLULAR HARVEY-RAS GENE TRUNCATED AND 121P 5

SOURCE 2 EXPRESSED IN (ESCHERICHIA COLI) 121P 6

AUTHOR U.KRENGEL,K.SCHEFFZEK,A.SCHERER,W.KABSCH,A.WITTINGHOFER, 121P 7

AUTHOR 2 E.F.PAI 121P 8

...

REMARK 1 121P 17

REMARK 1 REFERENCE 1 121P 18

REMARK 1 AUTH U.KRENGEL,I.SCHLICHTING,A.SCHEIDIG,M.FRECH,J.JOHN, 121P 19

REMARK 1 AUTH 2 A.LAUTWEIN,F.WITTINGHOFER,W.KABSCH,E.F.PAI 121P 20

REMARK 1 TITL THE THREE-DIMENSIONAL STRUCTURE OF P21 IN THE 121P 21

REMARK 1 TITL 2 CATALYTICALLY ACTIVE CONFORMATION AND ANALYSIS OF 121P 22

REMARK 1 TITL 3 ONCOGENIC MUTANTS 121P 23

REMARK 1 REF NATO ASI SER.,SER.A V. 220 183 1991 121P 24

REMARK 1 REFN ASTM NALSDJ US ISSN 0161-0449 2002 121P 25

...

SEQRES 1 166 MET THR GLU TYR LYS LEU VAL VAL VAL GLY ALA GLY GLY 121P 56

SEQRES 2 166 VAL GLY LYS SER ALA LEU THR ILE GLN LEU ILE GLN ASN 121P 57

SEQRES 3 166 HIS PHE VAL ASP GLU TYR ASP PRO THR ILE GLU ASP SER 121P 58

...


Formato pdb ii

Formato PDB II

HELIX 1 A1 LYS 16 GLN 25 1 121P 80

HELIX 2 A2 SER 65 THR 74 1 121P 81

...

SHEET 1 S 6 GLU 37 ILE 46 0 121P 85

SHEET 2 S 6 GLU 49 THR 58 -1 O LEU 53 N LYS 42 121P 86

SHEET 3 S 6 THR 2 VAL 9 1 N LEU 6 O ASP 54 121P 87

...

TURN 1 T1 ALA 11 VAL 14 121P 91

TURN 2 T2 ILE 46 GLU 49 121P 92

TURN 3 T3 ALA 83 ASN 86 121P 93

...

ATOM 1 N MET 1 -7.176 32.630 -6.655 1.00 14.06 121P 104

ATOM 2 CA MET 1 -5.913 31.928 -6.676 1.00 17.27 121P 105

ATOM 3 C MET 1 -5.903 30.860 -5.600 1.00 16.41 121P 106

ATOM 4 O MET 1 -6.703 30.881 -4.654 1.00 16.12 121P 107

ATOM 5 CB MET 1 -4.712 32.869 -6.415 1.00 17.94 121P 108

ATOM 6 CG MET 1 -4.594 33.420 -4.990 1.00 19.41 121P 109

ATOM 7 SD MET 1 -3.193 34.558 -4.899 1.00 21.82 121P 110

ATOM 8 CE MET 1 -4.325 35.886 -4.618 1.00 23.68 121P 111

ATOM 9 N THR 2 -4.966 29.934 -5.760 1.00 15.08 121P 112

ATOM 10 CA THR 2 -4.759 28.930 -4.751 1.00 16.71 121P 113

ATOM 11 C THR 2 -4.312 29.597 -3.441 1.00 16.63 121P 114

...

HETATM 1324 PG GTO 167 5.150 32.173 22.030 1.00 11.69 121P1427

HETATM 1325 O1G GTO 167 4.768 32.597 23.390 1.00 13.29 121P1428

HETATM 1326 O2G GTO 167 4.164 32.683 21.069 1.00 12.61 121P1429

HETATM 1327 O3G GTO 167 4.834 30.641 22.025 1.00 13.18 121P1430

...

X

Y

Z

B-factor


Dalla sequenza alla struttura

ATOM 1 CA GLU 225 -0.900 -1.002 39.233 1.00 70.00 1HXN 170

ATOM 2 C GLU 225 -0.185 0.146 39.970 1.00 70.00 1HXN 171

ATOM 3 O GLU 225 -0.514 1.329 39.758 1.00 70.00 1HXN 172

ATOM 4 N SER 226 0.788 -0.203 40.823 1.00 70.00 1HXN 173

ATOM 5 CA SER 226 1.534 0.805 41.594 1.00 70.00 1HXN 174

ATOM 6 C SER 226 2.231 1.806 40.681 1.00 68.89 1HXN 175

ATOM 7 O SER 226 1.883 1.952 39.514 1.00 70.00 1HXN 176

ATOM 8 CB SER 226 2.572 0.130 42.515 1.00 70.00 1HXN 177

ATOM 9 OG SER 226 3.237 -0.941 41.848 1.00 70.00 1HXN 178

ATOM 10 N THR 227 3.242 2.478 41.223 1.00 65.51 1HXN 179

ATOM 11 CA THR 227 3.989 3.417 40.410 1.00 70.00 1HXN 180

ATOM 12 C THR 227 4.274 2.705 39.080 1.00 56.25 1HXN 181

ATOM 13 O THR 227 4.179 3.296 38.022 1.00 44.63 1HXN 182

ATOM 14 CB THR 227 5.354 3.797 41.074 1.00 70.00 1HXN 183

ATOM 15 OG1 THR 227 5.114 4.682 42.172 1.00 70.00 1HXN 184

ATOM 16 CG2 THR 227 6.256 4.492 40.065 1.00 70.00 1HXN 185


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