Integrin inside -out Signaltransduktion in der T-Zelladhäsion

1. Integrininside-out Signaltransduktion in der T-Zelladhäsion Adhesion-Assay auf ICAM-1 Betreuerin: Jessica Grell

2. Zielsetzung • Untersuchung der Interaktion des Integrins LFA-1 mit seinem Liganden ICAM-1 • Untersuchung des Einflusses von verschiedenen Stimulatoren, sowie 2 verschiedener Inhibitoren

3. Integrine • wichtigste Familie der Adhäsions-Proteine • transmembrane α/β-Heterodimere: grosse • extrazelluläre Domäne & kürzere transmembrane • und intrazelluläre Domäne • Interaktion mit verschiedenen Liganden möglich • bei Leukozyten häufig β2-Integrine • Regulation durch Modulation von Affinität und • Avidität

4. Affinität: Stärke, mit der ein einzelnes Integrinmolekül an seinen monomeren Liganden bindet Änderung führt zu Konformations- änderung Avidität: gesamte Bindungsstärke zwischen multimeren Integrinmolekülen & ihren Liganden Erhöhung durch Aggregation der Integrine auf der Zelloberfläche

5. Adhesionassay • Adhäsion der T-Zellen an ICAM-1 wird durch LFA-1 vermittelt • LFA-1 bindet nicht konstitutiv an seinen Liganden: Aktivierung durch • intrazelluläre Signale nötig • verschiedene extrazelluläre Stimuli werden verwendet, um • intrazelluläre Signale auszulösen • verwendetet Stimuli: • PMA = Phorbolester; Strukturanaloga von DAG; aktiviert PKC • OKT 3 = aktivierender TCR-Antikörper • KIM 185 = aktivierender LFA-1-Antikörper

6. Inhibitoren 1.) SecinH3 Bindet spezifisch an Sec7-Domäne von Cytohesinen Inhibierung des Guaninnukleotid-Austausches (GEF-Funktion) Cytohesin-1 = positiver Regulator von LFA-1 & bindet direkt an zytoplasmatische Domäne von CD18 2.) Gö6850 (Bisindolylmaleimid I) Inhibitor von Proteinkinase C : bindet an ATP-Bindungstelle

7. Versuchsdurchführung • Coaten von 3 cm Schalen mit ICAM-1-Fc : • Beschichtung der Schalen mit goat-ant-human IgG Antikörper • ICAM-1-Fc : Fusionsprotein; carboxyterminaler Fc-Teil aus CH2 und • CH3 Domäne von humanem IgG1 • Fc-Teil wird von anti-human-IgG gebunden

8. Versuchsdurchführung • Vorbereitung der Zellen • 1,6 × 107 Jurkat-Zellen • Zugabe von Inhibitoren; Kontrolle nur mit DMSO • 60 min Inkubation bei 37 °C • Auftragen der Zellen auf Schale & Zugabe der jeweiligen Stimuli • Adhäsion der Zellen für 60 min bei 37 °C • Waschen der Schalen mit HBSS bis keine Zellen mehr ausserhalb • der Markierung sind • Zählen der Zellen

9. Ergebnisse Inhibitor: SecinH3 Stimulierung mit OKT3 wird stark gehemmt Inhibitor zeigt wenig Wirkung bei Stimulation mit KIM185

10. Ergebnisse Inhibitor: Gö6850 Bei PMA- Stimulierung wird am stärksten inhibiert

11. Fazit • PMA ist ein besserer Stimulator als OKT3 • PMA- und OKT3-Stimulation werden stark von den beiden • Inhibitoren beeinflusst • beide stimulieren intrazellulär den Signalweg • KIM185 stimuliert trotz Inhibitoren • Stimuliert LF-1 von aussen; keine Aufnahme in die Zelle • nötig; wirkt Inhibitor stark entgegen • Inhibitoren wirken beide stark • SecinH3: GEF-Funktion von Cytohesinen ist wichtig für die • Aktivierung von LF-1 • Gö6850: Hemmung von Cytokinase C führt zum Abbruch des • Signalweges